mcr-1基因介导黏菌素耐药性研究进展

周 洋，刘秋云，李玉宁，张丹艳

(西南大学动物科学学院，重庆 402460)

抗菌药是人类及动物对抗细菌感染的重要武器，然而随着抗菌药的过度使用，细菌耐药性已成为21世纪全球卫生和食品安全的最大威胁之一。在过去的30年，抗菌药研发速度趋缓，而多药耐药性却不断出现。世界卫生组织称，如不采取紧急行动，我们将进入后抗生素时代，即使普通感染和轻微损伤都会造成死亡。2010年在印度、巴基斯坦和英国出现产新德里金属β内酰胺酶(New Delhi metallo-beta-lactamase 1，NDM-1)“超级细菌”，对碳青霉烯类药物有耐药性。2013年再次发现产耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniaecarbapenemase 2，KPC-2)。碳青霉烯类抗生素耐药性的迅速出现限制了人类重症感染的用药选择，碳青霉烯类抗生素的使用受到限制，临床建议单用黏菌素或替加环素，或与其他药物联合使用。而黏菌素的大量使用又极大地提高了肠杆菌科对黏菌素耐药的风险。包括中国在内的一些国家，黏菌素也作为兽药使用[1]。

一般认为，细菌对黏菌素耐药是由于染色体上的基因变异引起，不能水平传播，而Liu Y Y等[1]在耐药性监测过程中发现近些年黏菌素耐药性显著上升，因此怀疑这种现象是通过质粒介导。对2011年-2014年从广东、广西、湖南、江西和浙江五省区的医院、生猪屠宰场、开放市场和超市采集的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌进行可能的质粒介导的耐药性分析，首次发现质粒上的mcr-1基因介导黏菌素耐药性，从而导致该耐药性水平传播。紧接着，在全球各地相继发现mcr-1基因，表明mcr-1介导黏菌素耐药性在世界已广泛存在。因此，了解mcr-1介导黏菌素耐药性情况、在细菌和宿主的传播、mcr-1阳性菌在全球的传播、耐药机制、mcr-1遗传背景、与其他耐药基因的共存情况以及mcr-1以外的质粒介导的黏菌素耐药机制，对指导黏菌素合理应用和新药研发有重要意义。

1 mcr-1介导黏菌素耐药性

1.1 mcr-1介导黏菌素耐药性的证据

体外试验表明，大肠埃希菌W3110电转化pUC18-mcr-1质粒后，对黏菌素和多黏菌素B的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)升高4倍[1]。同样，大肠埃希菌J53通过接合分别获得4株野生型大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌携带mcr-1的质粒后对黏菌素产生耐药[2]。体内试验表明，野生型 mcr-1阳性大肠埃希菌363R通过新生霉素处理后消除质粒得到大肠埃希菌363S，小鼠腿部感染106CFU的363R或363S后给药黏菌素，72 h体内363S载菌量下降3个对数级以上，363R仅下降1个对数级[1]。

1.2 mcr-1的稳定性

不管是野生型mcr-1阳性大肠埃希菌SHP45，还是通过接合获得大肠埃希菌SHP45中携带mcr-1的质粒pHNSHP45的耐链霉素的大肠埃希菌C600，无论添加黏菌素与否，连续传代14 d，耐药质粒稳定存在[1]。然而，mcr-1阳性菌株在保存后复苏，或者在没有黏菌素的培养基中连续传18代后，也会导致质粒丢失，并且恢复对黏菌素的敏感性。对荷兰2012年11月到2013年11月1 847名游客粪便样品进行分析，旅游前粪便不含有产超广谱β内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases，ESBL)肠杆菌科，旅游过程没有接受任何医疗护理和使用抗微生物药物，回国后1周～2周采样发现6人粪便含有mcr-1阳性大肠埃希菌，1、3、6、12月后再次检查，未检出这些细菌，表明这些细菌仅短时间寄居或mcr-1丢失[3]。

2 mcr-1介导黏菌素耐药性的传播

2.1 mcr-1在不同细菌之间的传播

mcr-1通过接合在大肠埃希菌之间转移，转移频率为10-3～10-1或10-7～10-1之间，在实验室可通过电转化转移给肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌。mcr-1在大肠埃希菌存在较普遍，发现于多个国家。其他细菌，如肺炎克雷伯菌[1]、产气肠杆菌和阴沟肠杆菌[4]、沙门菌(包括鼠伤寒沙门菌、罗森沙门菌[5-6])、乙型副伤寒沙门菌爪哇变种及魏尔肖沙门菌[7]，在少数国家有少数报道。弯曲菌和志贺菌尚未检测到mcr-1基因。

2.2 mcr-1在人与动物之间传播

mcr-1报道前，Olaitan A O等[8]对老挝的人、猪和山羊的粪便分离大肠埃希菌进行耐药性分析，发现15岁的男孩和他饲养的猪携带的耐黏菌素大肠埃希菌多位点序列分型、脉冲场凝胶电泳和毒力相同，当时已知的和黏菌素耐药有关的双组分调节系统，如pmrAB、phoPQ及mgrB，没有发现变异。男孩在饲养过程中没有任何防护措施，提示黏菌素耐药性从猪传递给人。Liu Y Y等报道mcr-1后，Olaitan A O等[9]测序结果发现该菌携带mcr-1。广州某宠物店工作人员患血管球性肾炎，从尿液中分离出mcr-1阳性大肠埃希菌，与其工作场所的4只犬粪便中分离出的mcr-1阳性大肠埃希菌多位点序列分型相同，并与脉冲场凝胶电泳结果一致，同时，该细菌可通过接合转移黏菌素耐药性到大肠埃希菌C600，表明mcr-1阳性大肠埃希菌可能在人和动物之间传播[10]。

3 mcr-1介导黏菌素耐药性的发生概况

3.1 mcr-1在全球范围的传播

继中国首次报道mcr-1介导黏菌素耐药性后，迅速在全球多个国家发现mcr-1基因的存在，分布于四大洲至少21个国家。对2008年-2016年采集的大肠埃希菌进行检测mcr-1发现，美国、波兰、俄国老挝、阿尔及利亚和泰国仅有零星报道[11-12]，英国(人、动物及食品中阳性率<0.1%)[7]、日本(食品动物中阳性率<0.1%)[13]、西班牙(人和猪中阳性率分别为0.1%和0.4%)[14]和巴西(人、动物、食品及环境样品中肠杆菌科阳性率为0.3%)[4]mcr-1阳性率低于0.5%，荷兰(鸡肉中阳性率1.5%)[15]、委内瑞拉(人、猪和禽的粪便以及下水道样品中阳性率为2.2%)[16]、南非(肉鸡中阳性率为2.4%)[17]、丹麦[18](人和进口鸡肉中阳性率分别为0.2%和2.0%)、德国[19](人和动物中阳性率分别为0.4%和2.3%)低于2.5%，法国2014年火鸡和肉鸡中mcr-1阳性率分别为5.9%和1.8%，中国2014年生猪屠宰场、零售鸡肉、零售猪肉和住院病人大肠埃希菌mcr-1阳性率分别为20.9%、28.0%、22.3%、1.4%，2011年-2014年基本呈现逐年上升趋势，而突尼斯3个鸡场的阳性率分别为20.0%、16.7%、83.3%。在耐药菌或产超广谱β内酰胺酶大肠埃希菌中筛查mcr-1，比利时(牛和猪中阳性率为12.4%)、越南(鸡、猪和生猪屠宰场中阳性率为37.5%)和阿根廷(人源大肠埃希菌阳性率为10.3%)均高于10%。mcr-1在大肠埃希菌以外的细菌中，如肺炎克雷伯菌[1](住院病人中阳性率为0.7%)、鼠伤寒沙门菌[7](人、动物和食品中阳性率低于0.1%)、乙型副伤寒沙门菌爪哇变种[7](人、动物和食品中阳性率低于0.1%)、魏尔肖沙门菌[7](人、动物和食品中阳性率低于0.1%)、罗森沙门菌[5-6](猪淋巴结中阳性率为0.6%)，mcr-1阳性率较低。

3.2 mcr-1在世界各国的流行情况

尽管在多个国家发现mcr-1阳性菌，但大多数报道没有发现呈现流行态势，食品动物的感染较人类感染更加严重，少数几个国家mcr-1阳性率高于2.5%，大部分国家mcr-1阳性率低于0.5%。国际化贸易促进了mcr-1的传播。1967年到2012年(主要是2008年-2012年)从欧洲、北美和东南亚采集的超过1 100株大肠埃希菌和550株肺炎克雷伯菌中，仅发现1株大肠埃希菌携带mcr-1，表明该质粒在这些细菌中没有广泛传播[20]。荷兰1 847名游客回国后发现6人粪便含有mcr-1阳性大肠埃希菌，1年内再次采样检测不出mcr-1[3]。mcr-1阳性大肠埃希菌人与动物之间的传播也仅有零星报道[9-10]。然而，突尼斯从法国进口的1日龄鸡的后代中，粪便抽样检测mcr-1阳性率高达83.3%[21]，远高于法国本土2013年和2014年肉鸡的mcr-1阳性率(分别为1.8%和1.6%)[22]。中国2011年-2014年生猪屠宰场、零售猪肉和鸡肉的mcr-1阳性率呈现上升趋势，2014年的阳性率均高于20%[1]。

3.3 mcr-1出现的历史

在已经公开的包括宏基因组在内的细菌基因数据集中追溯mcr-1，发现1 267份欧洲、中国和美国人粪便样品中有3个中国人肠道微生物携带mcr-1，另外24个中国人的肠道样品有mcr-1基因片段。由于这些论文在2011年8月提交，因此，采样时间应该在2011年前。这些结果表明mcr-1基因可能在中国已经存在很长一段时间了，并传播到健康人肠道，从而成为耐药基因储库和水平传播的潜在位点[23]。从300名5岁以下婴幼儿粪便中分离大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、弗氏柠檬酸菌和摩根氏菌共324株，其中有5株大肠埃希菌携带mcr-1。这些携带者年龄在2月龄～27月龄之间，居住位置不同，没有宠物或动物接触史，其中2名婴儿分别为2月龄和10月龄，尚未接触常规食品和食源性微生物，可见mcr-1已经在环境中普遍存在，或长期寄居于人体内并通过母体传播给下一代[24]。

Wu Congming等PCR检测20世纪70年代到2014年中国8个省的农场鸡源大肠埃希菌是否携带mcr-1，发现mcr-1阳性菌。最早可追溯到20世纪80年代，这个时候中国的食品动物才刚刚开始使用黏菌素，此后直到2004年和2006年才开始有零星出现，2009年暴发[25]。

4 mcr-1介导耐药性的机制

4.1 多黏菌素作用机理

多黏菌素含有10个氨基酸残基，其中7个氨基酸残基连接形成主环，剩余3个残基形成线性尾部与主环相连。多黏菌素含有6个L-α和γ-二氨基丁酸，L-α和γ-二氨基丁酸使多黏菌素在生理pH下带正电荷，革兰阴性菌外膜脂多糖上脂质A的磷酸基团带负电荷，二者通过静电相互作用，多黏菌素从外膜扩散到周质，导致膜上形成小孔，细菌崩解。多黏菌素的疏水性尾部在破坏膜过程中起重要作用，去除多黏菌素B裂解产物多黏菌素九肽的疏水性尾部虽不影响与脂多糖接合，也能增大细菌细胞壁对其他抗生素的通透性，但不能有效杀灭细菌。

4.2 MCR-1蛋白的结构

MCR-1蛋白包含2个结构域，即内膜结合结构域和预测含有催化中心的可溶性周质结构域。内膜结合结构域亲水性分布图预测N端200个氨基酸有5个跨膜α螺旋，i-Tasser同源建模确定2个磷酸乙醇胺转移酶的可溶部分和脑膜炎双球菌的LptA和空肠弯曲杆菌的EptC结构最相近，序列相似度分别是41%和40%。i-Tasser生成的MCR-1蛋白模型之间在N-端(假定的跨膜部分)有差异，但各模型间以及C端结构域的这两个结构的整体折叠非常一致。结构模型和序列比对的结果显示了MCR-1蛋白中保守的LptA和EptC对催化活性非常重要[1]。

为获得高MCR-1催化结构域的分辨率结构信息，进而了解MCR-1介导黏菌素耐药性的机制，构建缺失5个跨膜螺旋的MCR-1蛋白，锌X射线吸收限结果分析可见，在空间群P41212和P21中生成2个不同晶体形式的结构。两种结构基本一致，有1个α-β-α折叠，含3个分子内二硫键，典型的碱性磷酸酶或硫酸酯酶，并有相同的二聚体形式，但空间排阻色谱表明其在溶液中以单体形式存在，假定的活性位点至少含有1个锌离子。Thr285是磷酸乙醇胺的受体中的保守氨基酸残基，在P21结构的活性位点中Thr285结合了1个磷酸基团，表明晶体中同时也有磷酸化的形式。

4.3 mcr-1介导黏菌素的耐药机制

MCR-1的推导氨基酸序列与多种细菌的磷酸乙醇胺转移酶EptA非常接近，属于磷酸乙醇胺转移酶家族成员。MCR-1蛋白通过5个跨膜螺旋将其锚定细胞质膜的周质中，细菌的脂多糖在胞浆中合成后通过ABC转运蛋白MsbA翻转进入周质，脂多糖中的脂质A在周质中被磷酸乙醇胺共价修饰，修饰后的脂多糖与多黏菌素亲和力下降，从而导致对多黏菌素耐药性的产生。染色体上双组份调控系统介导的多黏菌素耐药机制，如pmrAB、phoPQ及mgrB，脂质A除了被磷酸乙醇胺修饰外，还包括4-氨基-4-果胶糖，甚至脂多糖全部丢失[1]。

5 mcr-1的遗传背景

5.1 mcr-1的来源

根据mcr-1与产多黏菌素菌的磷酸乙醇胺转移酶的进化关系， Liu Yiyun等认为mcr-1是从未知的产多黏菌素菌的染色体转移到大肠埃希菌的质粒上。Nicole Stoesser等对其采集的1株携带mcr-1的大肠埃希菌分析发现，mcr-1临近插入序列1 294(IS1294)，嵌套于ISApl1复合转座子中间。IS1294可利用单向滚环转座机制转座临近序列，因此mcr-1可能通过IS1294插入到ISApl1后，随后IS1294丢失，而mcr-1嵌套于ISApl1复合转座子中间也比较常见，但也有质粒缺失ISApl1[7,26]。

5.2 携带mcr-1的质粒的多样性

携带mcr-1的质粒呈现多样性，不相容组包括IncHI2、IncP、IncP、IncI2、IncFII、IncX4和IncF，质粒大小30 kb～300 kb，GC含量41.8%～46.06%，45个～83个开放阅读框。质粒同源性差距较大，与最早发现的pHNSHP45同源性最高达98%，最低仅4%。有的质粒中的ISApI1截短或完全缺失，编码转座酶的tnpA基因缺失。IncI2和IncX4均有一个长度约2 600 bp的mcr-1-pap2元件，可水平传播到不同的质粒中。mcr-1-pap2上、下游无同向或反向重复序列。pHNSHP45中，ISApl1直接插入到mcr-1-pap2上游，且mcr-1-pap2附近有一个25 bp的反向重复序列[2]。

5.3 染色体上的mcr-1基因

mcr-1也发现存在于染色体上，位于Tn9样复合转座子，暂时命名为TnApl，有两个位于mcr-1-pap2附近的同向重复的ISApl1元件。TnApl位于两个假定基因之间，含2 bp(TG)的推导靶位点重复序列[22]。

6 mcr-1与多药耐药

大肠埃希菌可同时携带mcr-1和多种耐药基因，从而产生多药耐药。委内瑞拉发现的一株mcr-1阳性大肠埃希菌的耐药谱包括β-内酰胺类药物(包括青霉素类，头孢菌素类和碳青霉烯类，耐药基因有blaNDM-1、blaTEM-1、blaACT-15、blaOXA-1和blaCTX-M-15)，氨基糖苷类药物[aadA5，aph(3′)-Ⅱa，aacA4，aac(3)-Ⅱa，strA，aadA15和strB]，氟喹诺酮类药物[aac(6’)-Ⅰb-cr和qnrB1]，大环内酯类药物[mph(A)和erm(B)]，酰胺醇类药物(catB3、catA1和floR)，磺胺类药物(sul1、sul2和sul3)，四环素类药物[tet(B)]，甲氧苄啶(dfrA1、dfrA12、dfrA14、dfrA17)[16]。另外，还发现mcr-1阳性大肠埃希菌同时携带fosA3(磷霉素耐药基因)lnu(F)(林可胺类耐药基因)。

7 其他质粒介导的黏菌素耐药基因

mcr-1介导的黏菌素耐药机制报道后，相继又发现了mcr-2和mcr-3。mcr-2长度1 617 bp，与mcr-1比较，同源性76.75%。携带mcr-2的可移动元件含1个ISXO2样转座酶结构域，是IS1595超家族的IS元件。mcr-2下游是一个长度为297 bp的开放阅读框，编码PAP2膜结合脂质磷酸酶。携带mcr-2的pKP37-BE质粒长度35 104 bp，GC含量41.3%，56个蛋白编码基因，不携带其他耐药基因。基于PCR筛选结果，比利时猪源大肠埃希菌的mcr-2流行性高于mcr-1[27]。携带mcr-3的pWJ1质粒261 kb，属于IncHI2不相容组，与mcr-1和mcr-2的同源性分别是45.0%和47.0%，推导氨基酸序列与肠杆菌科和气单胞菌的磷酸乙醇胺转移酶同源性分别是99.8%～100%和75.6%～94.8%。mcr-3上游含截短的杀鲑气单胞菌特有的转座子元件TnAs2[28]。

8 结语

mcr-1作为一种新的质粒介导的黏菌素耐药机制的发现改变了以前黏菌素只能水平传播的认识，引起了全球的广泛关注。我国黏菌素生产量和使用量均居于世界前列，并且黏菌素作为饲料添加剂使用。可能是黏菌素在动物上的大量应用产生的选择性生存压力，为mcr-1阳性菌提供了生存优势，因而我国的mcr-1阳性率也较高[1]。2016年7月26日，农业部2428号公告禁止硫酸黏菌素用于动物促生长。mcr-1与其他耐药基因的共存可能使更多的临床分离菌对黏菌素等耐药，从而进一步加剧了革兰阴性菌对人类健康的威胁。在缺乏有效的革兰阴性菌治疗药物的情况下，mcr-1对人类和动物的健康的威胁不容低估，mcr-1在革兰阴性菌上的监测和分子流行病学研究尤为必要。

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