猪肺炎支原体p97蛋白研究进展

刘 璐，刘玉芬

(哈尔滨师范大学生命科学与技术学院，黑龙江哈尔滨 150025)

猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae，Mhp)是引起猪呼吸道疾病综合征的一种重要因素，可以导致病猪生长发育不良、饲料转化率下降等，给养殖业造成重大的经济损失[1]。目前商品化的疫苗并不能阻断Mhp传播和动物肺部感染[2-5]。疫苗的研制要从致病机理入手，Mhp感染发生的第一步是黏附到猪呼吸道细胞上皮纤毛上，可导致上皮细胞坏死、纤毛脱落和游走性改变，影响纤毛的清除功能。在黏附过程中，其表面黏附蛋白发挥了重要作用。p97是发现最早而且研究比较深入的纤毛结合素蛋白，是Mhp主要抗原蛋白之一[6-8]。研究表明,p97蛋白能够引发机体产生最早的免疫应答反应，并且不同毒力株的p97R1区基因重复序列和菌株黏附能力存在一定关系[9-10]。由此可见，p97可以用于Mhp感染的早期诊断和不同毒株毒力强弱的分析及疫苗的研制。

1 p97的分子结构特征

Zhang Qijing等[11]最先利用单克隆抗体鉴定出p97蛋白，并指出p97位于Mhp膜表面，对呼吸道黏膜纤毛具有黏附功能。Hsu T等[12]对p97基因DNA测序分析后指出，p97结构基因编码一个124.9 ku的蛋白，该蛋白通过蛋白水解加工至102.9 ku，经处理的多肽在SDS-PAGE检测时显示为97 ku的蛋白。推定RNA聚合酶结合区位于ATG起始密码子上游145 bp处。蛋白质有非常少的疏水区， 单个由17个氨基酸组成的疏水区域即可跨越氨基末端的膜。该蛋白有两个重复序列位于C端，其中一个有15个连续重复的5氨基酸(AAKPV/E)序列，即R1区；另一个是由4个连续重复的10氨基酸(GTPNQGKKAE)序列构成的R2区。Hsu T等[13]进一步围绕p97结构基因的DNA序列分析，揭示了由两个开放阅读框组成的操纵元，p97和一个编码102.3 ku蛋白的p102。通过杂交分析和亚克隆试验得出p97蛋白编码基因以单拷贝存在于猪肺炎支原体染色体上。Hsu T等[14]在体外利用微量滴定板黏法定量测定截短的p97基因产物对支原体黏附能力以鉴定纤毛结合位点，研究表明，纤毛结合位点位于p97基因AAKPV(E)重复序列中，简称R1重复。Minion F C等[15]通过免疫印迹分析得出纤毛结合至少需要8个p97蛋白R1区重复基元，3个重复基元是抗体识别所必须的。在没有至少8个重复的R1区存在的情况下，位于R1区附近的R2区可能起到协助结合猪纤毛的作用。随后，有研究报道R1、R2区在Mhp不同株中序列高度保守。Yang Wenjen等[16]利用噬菌体展示肽库和能够刺激机体产生免疫应答的噬菌体表位对Mhp表位作图，利用A蛋白从兔抗Mhp高免疫血清中纯化得到的抗体IgG对噬菌体展示的随机肽库进行筛选，并对筛选出的阳性噬菌体克隆进行测序分析，结果显示出有大量的模拟表位出现在p97序列不同位置上，并且多数集中在p97蛋白C末端的R1和R2区域。用含有p97 R1序列的阳性噬菌体克隆对小鼠进行腹腔内免疫和鼻内接种，获得的抗血清经Western blot分析主要与p97蛋白反应，并且可以抑制Mhp的生长，进一步确定了p97蛋白R1区存在Mhp的关键表位。

2 p97蛋白的免疫原性

为鉴定在真核细胞表达的p97蛋白的免疫原性，王凯等[17]构建了MhpR659株p97基因重组腺病毒Ad-p97，用其在PK15细胞中的表达产物接种小鼠，获得的抗Ad-p97血清能竞争性结合在Mhp表面的黏附位点，抑制Mhp与宿主细胞的结合。Ad-p97免疫猪后可诱导猪产生特异性抗体。陈超等[18]将构建成功的p97 C末端基因重组腺病毒质粒转染AD293细胞以获得高滴度、高纯度的重组腺病毒，利用小鼠进行动物试验，结果表明该重组质粒肌肉注射小鼠刺激小鼠产生了特异性体液免疫，滴鼻可诱发体液免疫和黏膜免疫，但不能诱导小鼠产生细胞免疫应答，说明了p97蛋白具有良好的免疫原性。

3 p97蛋白与Mhp的检测

目前，检测Mhp的方法主要有分离培养、PCR及血清学检测等。支原体较难分离培养，且生长速度缓慢，此方法耗时久、效率低[19-20]。普通PCR检测方法具有较高的准确度和实用性，且花费少，但敏感性低，无法对未知样本进行定量[19,21-22]。天然感染的猪血清ELISA检测不能用于抗体血清转化前的早期感染，而且常见的IDEXX血清学试剂盒价格昂贵，不适合用于大范围的检测[23]。荧光定量PCR检测方法具有操作方便、特异性好、灵敏度高等优点，武昱牧等[24]以p97基因的保守序列为模板设计了引物和探针，建立了TaqMan-BHQ荧光定量PCR检测方法。在扩增猪其他常见病原体时无扩增反应，具有良好的特异性，为猪支原体肺炎的诊断提供了技术储备。Feng Zhixin等[25]通过对猪体内抗p97 R1、p36、p46的血清IgG抗体和呼吸道黏膜SIgA抗体的动力学研究，在感染后抗P36、抗P46应答进展缓慢，而p97抗体的血清学转化发生较快，试验感染早期即可检测到针对p97R1的抗体IgG，同时发现针对p97R1的黏膜抗体SIgA浓度最高。系统免疫应答发生较晚持续时间长，而黏膜反应则相反。由于黏膜免疫反应最早出现的是SIgA抗体，它能够阻断病原体和黏膜细胞表面上受体之间相互作用，而且不会在无活性疫苗单独接种后产生。Feng Zhixin等[26]又将p97R1区在大肠埃希菌中的表达产物作为包被抗原建立了SIgA-ELISA方法用于检测Mhp感染的试剂盒，其灵敏度、准确度和特异性较高。与商品化IgG-ELISA试剂盒相比，该试剂盒可以成功区分Mhp感染猪和疫苗接种猪。

4 p97蛋白与疫苗研发

Shimoji Y等[27]用减毒的YS-19株猪红斑丹毒丝菌递送p97蛋白C末端部分到猪呼吸道黏膜表面，在动物实验中对肺部病变的组织病理学检测结果显示，与对照组猪相比，YS-19疫苗免疫猪肺部病变程度大大降低。然而研究者未在任何免疫猪的血清中检测到抗p97的IgG、IgM和IgA抗体,但在用p97蛋白免疫猪后第7天，YS-19免疫的猪外周血单核细胞的刺激指数明显高于对照组，由此推测YS-19株的鼻内疫苗可能诱导免疫猪产生针对p97蛋白的细胞免疫应答。Okamba F R等[28]发现携带p97C端R1、R2区的重组复制缺陷型腺病毒亚单位疫苗接种猪后能够在猪体内诱导针对p97C重组蛋白的特异性黏膜以及全身性免疫应答，在接种动物体内表现为产生较高水平的p97C特异性抗体IgG以及血清和唾液中的抗体IgA，甚至在猪出现炎症之前。而且，接种猪宏观肺部病变、从组织中回收的猪肺炎支原体的量、局部炎症都有所减少。de Oliveira N R等[5]将包括p97R1蛋白在内的四种抗原蛋白制成菌苗免疫小鼠，发现该嵌合蛋白能够诱发小鼠产生特异性抗体IgG。此外，在一些研究报道中，用重组p97作为亚单位疫苗、融合到黏膜佐剂、与减毒细菌或病毒载体结合免疫猪后，成功缓解了支原体肺炎的病情。这些结果说明了p97蛋白可作为疫苗研发的候选蛋白。

5 小结

由于猪支原体肺炎具有持续时间长、难治愈、常诱发患病猪其他病原体感染等特点，因此对于该病的早期诊断试剂盒的研发和疫苗研制工作均迫在眉睫。p97蛋白作为Mhp最主要的抗原黏附蛋白，许多研究均证实其具有良好的免疫原性，然而其在Mhp感染过程中的致病机制依然不得而知。尽管p97 R1区已被证实具有黏附纤毛的功能，但Mhp感染是多种黏附蛋白共同发挥作用导致的。以单独的p97抗原作为Mhp疫苗，虽然能够诱导血清抗体的产生，但只能对猪起到部分免疫保护作用。因此，将p97与其他Mhp抗原蛋白共同用于疫苗的研发是否可以提高疫苗的免疫原性，以及p97蛋白在Mhp感染过程中的机制依然有待更深入研究。

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