哈蟆油对哮喘豚鼠炎性因子及肺组织病理变化的影响

仇志凯，曲 元，马 超，律广富， 常诗卓，叶鸿 博，林 贺，林 喆*

（1.长春中医药大学， 长春 130117 ；2.长春人民药业集团有限公司 公益管理平台， 长春 130021）

哈蟆油（Oviductus Ranae）为中国林蛙雌蛙输卵管的干制品，是其主要药用部位，自1985年被《中国药典》收录。性平，归肾、肺经，味甘、咸，具有养阴润肺、补肾益精、健脾养胃之功效[1-2]。目前，对于支气管哮喘的发病机制，西医认为，多是由气道炎症导致[3]，广泛认同的是IgE介导的I型超敏反应导致的炎性浸润。祖国医学则认为，哮喘是由于肺肾气虚所致，《类症治裁·喘证》指出：“肺为气之主，肾为气之根，肺主出气，肾主纳气，阴阳相交，呼吸乃和，若出入升降失常，斯喘作焉”[4-5]。本研究从哈蟆油滋阴润肺的传统功效入手，分析其对豚鼠血中炎性因子及肺部病理变化的影响，探讨哈蟆油对哮喘的现代药理作用机制。

1 材料

1.1 动物 SPF健康豚鼠，60只，体质量250～300 g，长春市亿斯实验动物有限公司提供，合格证号：SCXK（吉）- 2016-0004。

1.2 试剂 哈蟆油（通化鼎参药业），醋酸地塞米松片（遂成药业股份有限公司，160226），卵清蛋白（Sigma，#SLBS6919），氯化钠（北京化工厂，20170117），水合氯醛（天津大茂化学试剂厂，20160320），无水乙醇（北京化工厂，20170515），4%多聚甲醛固定液（长春金泰化玻，20170621），二甲苯（北京化工厂，20170410），苏木精染液（长春赛默瑞特，SM-RT-001），伊红染液（长春赛默瑞特，SM-RT-007），IL-4、IL-5、IgE酶联免疫试剂盒（上海源叶，E20170601A）。

1.3 仪器 WP-UP-III-40精密型超体纯水机（四川沃特尔科技发展有限公司），MS-PB型磁力搅拌器（DRAGON LAB），JA2003B分析天平（上海越平科学仪器有限公司），JSC-202超声雾化器（辽宁鞍山电子医疗仪器厂），Multiskan FC型酶标仪（上海赛默飞世尔），TS-12U型生物自动组织脱水机（湖北孝感宏业医用仪器有限公司），TB-718D型生物组织包埋机（湖北泰维科技），HM340E型切片机（Thermo Scientifi c），TR-180型生物组织全自动染色机（湖北泰维科技），DM2500型显微镜（德国徕卡）。

2 方法

2.1 药物的制备

2.1.1 造模药的制备 生理盐水：4.5 g NaCl，溶于500 mL dd H2O；10%卵清蛋白：准确称取卵清蛋白5 g，溶于50 mL生理盐水；1%卵清蛋白：准确称取卵清蛋白2.5 g，溶于250 mL生理盐水。

2.1.2 治疗药的制备 地塞米松：根据阳性组豚鼠体质量，按给药量1 mg/kg、给药体积1 mL/100 g称取地塞米松并溶于相应蒸馏水中；哈蟆油高、中、低剂量药物的制备：根据给药量400、200 、100 mg/kg称取蛤蟆油，按给药体积1 mL/100 g用相应ddH2O充分泡发24 h后，匀浆机制备成混悬液。

2.2 分组 60只健康豚鼠，每组10只，按体质量随机分成空白组、模型组、阳性对照组（地塞米松，1 mg/kg）、哈蟆油高、中、低剂量组（400、200、100 mg/kg）。

2.3 造模 适应性饲养1周后，各组腹腔注射给予1 mL的10%卵清蛋白，腹腔注射后第8天开始，除空白组外，各组豚鼠分别放入雾化诱喘仪容器内，用1%卵清蛋白进行雾化吸入激发诱喘5 mim（首次雾化时，若出现呼吸急促，尖叫，四肢瘫软症状，立刻取出豚鼠），隔日1次，共计7次；空白组用等量生理盐水进行同等操作[6-8]。

2.4 给药 腹腔注射后第8天开始，每次雾化前30 min进行灌胃给药，空白组和模型组给予生理盐水、阳性组给予地塞米松1 mg/kg、哈蟆油高、中、低剂量组给予哈蟆油混悬液400、200 、100 mg/kg，给药体积均为1 mL/100 g。

2.5 动物处理 末次雾化20 min后，腹腔注射10%水合氯醛（300 mg/kg）予以麻醉，进行采样。

2.5.1 炎性因子检测 腹主动脉取血，置于常规10 mL的EP管中，3 000 r/min离心10 min后，分离血清，按照试剂盒说明书，采用酶联免疫法检测血清中IL-4、IL-5、IgE的含量。

2.5.2 病理切片的取材及制作[9-10]打开胸腔，分离右中肺组织，置于4%多聚甲醛固定液固定，经70%～100%乙醇梯度脱水、二甲苯透明后，进行常规石蜡包埋、切片、苏木精-伊红染液染色，通过病理图像分析系统观察肺部组织病理变化情况。

2.6 统计学方法 实验数据用SPSS 19.0进行统计分析，数据用均数±标准差（）表示，组间比较进行t检验，P＜0.05具有统计学意义。

3 结果

3.1 对血清中IL-4、IL-5、IgE含量的影响 给药后与模型组相比，阳性对照组、哈蟆油高、中剂量组均能显著降低IL-4、IL-5、IgE的含量（P＜0.01），而哈蟆油低剂量组的疗效稍弱一些（P＜0.05）。见表1。

表1 各组豚鼠外周血中IL-4、IL-5、IgE含量变化（，n = 10）

表1 各组豚鼠外周血中IL-4、IL-5、IgE含量变化（，n = 10）

注：与空白组比较，## P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

组 别 IL-4/（pg/mL） IL-5/（pg/mL） IgE/（μg/mL）空白组 6.76±1.39 11.26±1.66 33.64±4.66模型组 11.81±3.84##28.53±3.62##67.88±6.18##阳性对照组 7.18±5.08△△13.26±3.20△△37.13±6.49△△哈蟆油高剂量组 8.51±2.70△△12.49±3.79△△34.06±9.85△△哈蟆油中剂量组 9.05±1.50△△13.93±2.40△△38.85±8.91△△哈蟆油低剂量组10.96±6.76△ 22.54±5.44△ 56.39±4.02△

3.2 肺部组织结构的病理改变 显微镜下观察肺部组织的病理改变，通过病理图像处理软件获取图像：与空白组相比，其余各组均出现不同程度的炎性细胞浸润、组织平滑肌增厚以及气道变窄现象。模型组最为显著，表现为大量炎性细胞聚集对组织造成炎性浸润、平滑肌增厚、气道变窄；与模型组相比，阳性对照组和哈蟆油高剂量组的炎性细胞明显减少、组织增厚现象显著降低；与阳性对照组、哈蟆油高剂量组相比，哈蟆油中、低剂量组炎性细胞有所增加，组织增厚，但相对于模型组，依然明显降低。病理结果提示，哈蟆油可降低哮喘豚鼠的肺部组织的炎性浸润及气道损伤，从而减轻豚鼠哮喘症状。

4 讨论

目前，对于支气管哮喘的发病机制，在西医临床还未完全明确，主要有气道重塑、IgE介导的I型超敏反应、炎性浸润等。其中被广泛认同的是I型超敏反应导致的炎性浸润，大量研究[11]证明，哮喘发生时，机体的Th1/Th2会出现严重的失衡现象，导致Th2占主导，产生大量的IL-4、IL-5（其中IL-4是其特征性细胞因子），并进一步促进免疫球蛋白IgE和嗜酸性粒细胞EOS的活化和聚集，使气道出现大量黏液并伴随纤维化增厚现象。所以，检测IL-4、IL-5以及IgE的含量，对于哮喘的判别有一定的说明意义。

中医认为，哮喘是“水湿内聚为痰，伏藏于肺，遇外邪诱发，痰阻气道发为哮病。”《素问·五藏生成篇》指出：“诸气者皆属于肺。”肺脏受损，则一身之气受损，运行不畅，致虚致瘀，气属阳，久瘀则生热，灼伤阴液，转变为肺阴虚证。哈蟆油则兼具养阴润肺、补肾益精的双重作用[12-15]。

通过本实验证明，哈蟆油可显著降低豚鼠血清中的IL-4、IL-5、IgE的含量、并且显著减少豚鼠的肺部组织的炎性浸润，避免炎性因子对肺部造成损伤；同时降低组织平滑肌增厚，气道狭窄等症状，利于肺气及津液的流动，减轻“喘证”的发作，其作用机制应该与调节机体的Th1/Th2失衡、降低炎性细胞的分泌，改善肺部气道重塑有关，从而缓解机体的哮喘症状。其相应的信号通路，有待进一步研究证实。

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