产蛋白酶、淀粉酶芽孢杆菌的筛选及鉴定

王玉田，郑瑞峰，韩明渠，李富伟

（ 1.北京市畜牧总站，北京 100101；2.北京科为博生物技术研究院，北京 102609）

蛋白酶和淀粉酶都是重要的水解酶类，已在饲料、食品和医药等领域得到广泛应用[1]。在饲料行业中，蛋白酶和淀粉酶以内源性消化酶添加到饲料中补充动物自身消化酶分泌不足。许多研究结果表明，饲料中添加蛋白酶和淀粉酶可提高饲料利用率、促进动物生长、减少粪便的排放，在改善养殖环境以及防治动物疾病等方面具有明显效果[2-3]。

由于芽胞杆菌分泌的蛋白酶和淀粉酶大多为胞外酶，其与动植物源的蛋白酶和淀粉酶相比具有菌体筛选简单易于培养、产量高、价格低廉等优点，使得芽胞杆菌源蛋白酶和淀粉酶的研究成为国内外研究热点[4]。本试验研究通过平板初筛结合酶活力测定，旨在筛选具有高产蛋白酶、淀粉酶复合酶能力的芽孢杆菌菌株。

1 试验材料

1.1 菌种

北京科为博生物技术研究院实验室保藏的芽孢杆菌。

1.2 培养基

1.2.1 初筛培养基

产蛋白酶初筛培养基：酪素10 g，蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，NaCl 5 g，葡萄糖5 g，琼脂粉16 g，蒸馏水1 L，pH 7.0，121℃灭菌30 min。

产淀粉酶初筛培养基：可溶性淀粉10 g，葡萄糖5 g，胰蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，NaCl 5 g，琼脂粉16 g，蒸馏水1 L，pH 7.0，121℃灭菌30 min。

1.2.2 种子培养基

葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，牛肉膏5 g，NaCl 5 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，CaCl20.2 g，蒸馏水1 L，pH 7.0，121℃灭菌30 min。

1.2.3 发酵培养基

玉米粉30 g，黄豆饼粉20 g（水解液，加0.5%NaOH，121℃水解30 min，冷却、过滤）、蛋白胨2 g，KH2PO41.5 g，K2HPO41.5 g，（NH4）2SO41.5 g，MnSO40.1 g，MgSO40.6 g，NaCl 2 g，葡萄糖 5 g，CaCl20.3 g，吐温-80 0.3 mL，蒸馏水1 L（pH自然，121℃灭菌30 min）。

2 试验方法

2.1 菌株筛选

2.1.1 初筛

将芽孢杆菌菌种活化，接种在营养肉汤培养基中，37℃摇床振荡培养12 h，芽孢杆菌活化液分别接种于酪素琼脂平板和可溶性淀粉平板上，37℃培养2～4 d，然后观察酪素琼脂平板有无水解圈，判断芽孢杆菌产蛋白酶活性，通过卢戈氏碘液染色法确定是否产淀粉酶。

2.1.2 复筛

将活化的芽孢杆菌菌液接种于种子培养基中，37℃培养12 h，然后以2%的接种量接种于发酵培养基中，37℃，160 r·min-1，摇床培养48 h。发酵培养24 h后补加葡萄糖使整个发酵过程中葡萄糖含量大约保持在0.5%。离心（4 000 r·min-1，20 min）收集上清液即为待测粗酶液，采用福林酚法测定粗酶液蛋白酶活力，采用碘液法测定淀粉酶活力[5-6]。

2.2 菌种的鉴定

2.2.1 形态学鉴定

观察划线纯化后的菌落形态，并进行革兰氏染色镜检。

2.2.2 生理生化鉴定

接触酶、氧化酶测定及碳水化合物发酵产酸试验方法，参照《常见细菌系统鉴定手册》[7]。

2.2.3 分子生物学鉴定

gyrB基因的PCR扩增与测序：以基因组DNA为模板PCR扩增gyrB基因，扩增引物采用gyrB-（5'-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGG NAARTTYGA-3'）和gyrB-R（5'-AGCAGGGTACGGA TGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3'）（北京睿博兴科生物技术有限公司合成）[8]。PCR反应体系（20 μL）：10×Buffer 2 μL，dNTPs 2 μL，10 mol·L-1引物 1 μL，Taq DNA 聚合酶 0.2 μL，DNA模板1μL，ddH2O补足至20 μL。PCR反应程序为：95℃预变性5 min；95℃30 s，55℃30 s，72℃2 min，32个循环，最后72℃10 min，扩增的PCR产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳检测。

基因序列测定及系统发育分析：扩增产物序列测定由北京睿博兴科生物技术有限公司完成。将所得序列在GenBank数据库中进行BLAST，然后选择相似性较高的模式菌株序列，利用MEGA 6.0软件进行多序列同源性比对，用邻位相连法构建系统发育树，并进行1 000次重复的Bootstraps统计学检验。

3 试验结果

3.1 产蛋白酶和淀粉酶芽孢杆菌的筛选

通过酪素平板和可溶性淀粉平板初筛，得到6株同时具有产蛋白酶、淀粉酶的芽孢杆菌菌株。发酵复筛结果见表1。菌株CA01216和CA02003有较高蛋白酶活力，分别为7 126.55、8 723.16 U·L-1，菌株CA01027和CA02003有较高的淀粉酶活力，分别为274.96、251.19 U·L-1。其中，菌株CA02003的蛋白酶和淀粉酶活力均较高。

表1 产蛋白酶和淀粉酶芽孢杆菌筛选

3.2 菌种鉴定

3.2.1 形态特征、生理生化特征

细胞形态为杆状，革兰氏染色呈阳性，有芽孢，孢囊不膨大。接触酶、氧化酶反应和VP试验均呈阳性，β-半乳糖苷酶呈阴性，生长试验和碳水化合物发酵产酸试验结果见表2。

表2 生理生化特征

2.2.2 gyrB基因序列系统进化分析

菌株CA02003的gyrB基因测序结果在GenBank中进行Blast比对分析，其序列全长为1 113 bp，与芽孢杆菌属的gyrB基因序列相似性最高。选取Paenibacillusamylolyticus BCRC 14684（EU272024）作为外类群，利用Mega 6.0软件构建菌株CA02003与芽孢杆菌属部分模式种gyrB基因系统发育树。如附图所示，菌株CA02003与Bacillus licheniformis BCRC 11702（DQ309295）同处一个进化分支，亲缘关系最近。

附图 gyrB基因序列系统发育树

通过菌落形态特征、生理生化特征以及gyrB基因序列的系统发育分析结果，将菌株CA02003初步鉴定为地衣芽孢杆菌。

4 讨论

本试验研究采用酪素平板和可溶性淀粉平板初筛，产酶活力测定复筛，得到一株具有产蛋白酶和淀粉酶复合酶芽胞杆菌菌株CA02003。通过形态特征、生理生化特征以及gyrB基因进化分析结果，鉴定为地衣芽孢杆菌。

目前，产蛋白酶和淀粉酶的微生物菌株的文献报道很多。马校卫等从高温大曲样品中筛选获得1株产耐热性蛋白酶的苏云金芽孢杆菌[9]。鲁珍等从高温大曲样品中筛选获得1株高产中性蛋白酶的解淀粉芽孢杆菌，优化后产酶能力达到706.13 U·g-1[10]。李习从白云边高温大曲中筛选得到的产耐高温α-淀粉酶地衣芽孢杆菌，淀粉酶活力达到334.32 U·mL-1[11]。王鹏昊等从白酒酒曲中筛选得到的米曲霉具有较高的蛋白酶活力（酶活性为324.72 U·g-1）和α-淀粉酶活力（225.76 U·g-1干曲）[12]。但高产蛋白酶、淀粉酶复合酶芽胞杆菌的研究报道很少，本文研究筛选获得的地衣芽孢杆菌具有高产蛋白酶、淀粉酶复合酶能力，在酶制剂生产中具有较大的应用潜力。

[参考文献]

[1] 陈坚,刘龙,堵国成.中国酶制剂产业的现状与未来展望[J].食品与生物技术学报,2012,31（1）:1-7.

[2] Ludovic,Lahaye,Robert,等.蛋白酶在动物生产中的应用[J].饲料与畜牧:新饲料,2011（7）:41-45.

[3] 唐小懿,马杰,王兴吉.淀粉酶在畜禽饲料中的应用研究进展[J]. 饲料研究,2017（11）:4-7.

[4] 秦艳梅,刘春卯,郑翔,等.微生物中性蛋白酶在食品工业的最新进展及应用前景[J].食品工业,2017,38（3）:210-213.

[5] 中华人民共和国国家标准.GB/T 23527-2009蛋白酶制剂[S].

[6] 中华人民共和国国家标准.GB/T 24401-2009α-淀粉酶制剂[S].

[7]蔡妙英,东秀珠.常见细菌系统鉴定手册[M].科学出版社,2001.

[8] Nochi Z,Sahebekhtiari N,Kharaziha P,et al.Comparison of 16S rRNA,23S rRNA and gyrB genes sequences in phy⁃logenetic relationships of Shigella isolates from Iran[J].An⁃nals of Microbiology,2009,59（3）:615-622.

[9] 马校卫, 颜林春,汤二将,等.高温大曲中产耐热性蛋白酶芽孢杆菌的筛选和鉴定[J].食品工业科技,2012,33（15）:169-173.

[10] 鲁珍,谌馥佳,李恩中,等.高产中性蛋白酶菌株的筛选及其产酶条件的研究[J].黑龙江农业科学,2016（5）:110-113.

[11] 李习.高产α-淀粉酶地衣芽孢杆菌的筛选及重组质粒的构建[D].武汉:湖北工业大学,2014.

[12] 王鹏昊,关统伟,邓奥宇,等.酒曲中高产蛋白酶和α-淀粉酶霉菌菌株的筛选与分子鉴定[J].酿酒科技,2016（6）:61-64,71．