一种食品中猪源性成分的快速检测技术

李 鑫，孙甸甸，张慧娟，冯娜娜，尹秋源，尹 锐

（吉林农业科技学院，吉林132101）

1 前言

近年来，食品安全问题日益突出，其中肉及其制品的掺假现象十分严重，成为行业、消费者和研究人员关注的焦点。2013年西安通报了一起“9.10”特大制贩假牛肉案，共查处17t假牛肉，这些假牛肉其实均为猪肉[1]。虽然食用猪肉不会对食品安全产生直接的影响，但是这揭示了食品供应链可追溯性存在的问题。猪肉由于价格相对便宜，一些商家为获取暴利，将猪肉掺入牛、羊肉出售。这种行为严重扰乱了市场秩序；危害了消费者的健康和经济利益；同时也造成一些宗教信仰方面的担忧和恐慌[2]。因此，通过物种鉴别实验对猪源性成分进行检测尤为重要[3-5]。

基于蛋白质的检测和DNA的检测是动物源性成分鉴别的主要方法。基于蛋白质的检测技术包括电泳分析法[6]、色谱分析法[7]和免疫分析法[8]等；肉制品中蛋白质会受到多种因素的影响，即使同一物种间也会存在一定的差异，且加工食品中蛋白质易发生变性而无法检出。相对于蛋白质，DNA具有较高的热稳定性和种属特异性[9-10]。近年来，基于 DNA的方法，包括DNA杂交[11]、PCR-RFLP[12]和物种特异性PCR[13]等被用于动物源性成分的检测研究。物种特异性PCR由于检测快速，特异性强、灵敏性高的优势，已经成为动物源性成分鉴定的主流方法[14]。

本研究根据猪线粒体cytb基因设计特异引物用于猪源性成分的检测。为相关执法部门打击不法商贩、维护消费者合法利益提供有力科学依据。

2 材料与方法

2.1 材料与试剂

猪、羊、牛、鸡、鹅、鸭肉均购置长春市某地方市场，购买后经形态鉴定。 猪肉火腿（n=4）、熟猪肉(n=7)、牛肉脯(n=6)、肉牛罐头(n=9)、牛肉卷(n=7)购自某超市，同一种类的肉制品均来自不同的生产厂家。

PCR Master Mix试剂盒 (美国ABI公司);蛋白酶K;CTAB、EDTA、Tris-HCl、NaCl、氯仿、异戊醇、Tris 饱和酚、异丙醇、70%乙醇（均购自上海生物工程有限公司)。

2.2 方法

2.2.1 DNA提取 将猪肉样品和其他肉制品剪碎，分别准确称取各肉样0.1g，液氮研磨后转移至1.5mL离心管中，加入800μL 裂解液 (每 100mL 含 CTAB 1 g、EDTA 0.3722g、Tris-HCl 0.7882g、NaCl 4.09g,调至 pH8.0,高温高压灭菌)，65℃孵育 30 min，期间振荡混匀3～4次，12000×g离心5min；上清液移入一洁净离心管中，加入 400μL三氯甲烷-异戊醇(24∶1)，振荡混匀后12000×g离心5min；取上清液于另一洁净离心管中，加入320μL异丙醇，室温沉淀30 min；12000×g离心5min，弃上清液，向沉淀中加入500μL 70%乙醇漂洗，12000×g离心5min，弃上清液，沉淀晾干，用20μL TE缓冲液溶解沉淀，经OD值测定后于-20℃保存。

2.2.2 特异性引物的设计 在GenBank中检索猪线粒体cytb基因序列(accession KY432578.1)。用 DNAStar软件设计特异性引物。对确定的基因特异引物经GeneBank (http∶//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)中Blast程序进行相似序列搜索后，确定其与常见动物源性成分无交叉反应，用于实验。本研究的特异性引物序列如下，上游引物：5’-ATGAAACATTGGAGTAGTCCTACTATTTACC-3’ (31 bp,Tm 63.3℃),下游引物∶5’-CTACGAGGTCTGTTCCGATATAAGG-3’ (25 bp,Tm 64.6℃)；引物由上海生物工程有限公司合成。

2.2.3 PCR反应体系和反应条件 PCR反应体系∶其中PCR Master Mix 5.2μL,10μmol/L 引物各 0.8μL,模板 DNA 1μL,ddH2O 17.2μL，总体积 25μL。 反应条件如下∶95℃预变性 5min,95℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸30s,40个循环。

2.2.4 PCR产物的电泳检测 将5μL PCR产物在2%琼脂糖凝胶上于110V下电泳30分钟，凝胶成像系统记录实验结果。

2.2.5 灵敏度及特异性 为验证该方法的灵敏性，用双蒸馏水对纯化的猪肉DNA进行10倍梯度稀释，使每个PCR反应中的猪肉 DNA 含量分别为 10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg。PCR扩增后取上述PCR产物5μL经2%琼脂糖凝胶电泳检测。为验证该方法的特异性，分别提取猪、羊、牛、鸡、鹅、鸭肉基因组DNA，分别以1ng上述基因组DNA为模板进行PCR扩增，经电泳检测以验证该方法的特异性。

2.2.6 实际样品的检测 从超市购买销售比例较大并标明成分的33份猪肉及牛肉制品,如2.1分别按上述方法提取其基因组DNA，通过猪源性PCR-电泳检测以评价其在实际样本检测中的适用性。

3 结果与讨论

3.1 特异性实验

本研究根据猪线粒体cytb基因设计引物，分别对猪及其他5种动物源性成分（羊、牛、鸡、鹅、鸭）的DNA样本进行PCR扩增，扩增结果通过电泳检测。仅猪DNA检测结果呈阳性，其他对照以及空白对照均为阴性（如图1）。因此，该方法具有较高的特异性。

3.2 灵敏性实验

将纯化的猪肉DNA进行10倍梯度稀释，分别作模板进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测，其灵敏度达到100pg（如图2）。

3.3 商业样品的检测

从超市购买销售比例较大并标明主要成分的33份猪肉及牛肉制品，用上述方法提取待测样品DNA，通过猪源性成分PCR-电泳检测，每个样品做了一个平行样。所有的猪肉制品检测结果均为阳性；在部分牛肉罐头、牛肉脯等干制品中检测出猪源性成分，结果见表1。对检测结果与商品标识不一致的样品，对其PCR扩增产物进行基因测序，测序结果与预期的猪源性基因序列相符。因此，猪源性成分PCR-电泳检测技术在商业样本及复杂食物样本的检测中具有较高的准确性；另外，市场上存在牛肉制品掺假猪肉的现象，肉制品掺假确实是食品行业的一项重要问题。

4 结论

本研究将聚合酶链式反应和琼脂糖凝胶电泳检测相结合，建立了一种猪源性成分PCR-电泳检测技术。该方法对猪源性成分的检测具有较高的灵敏度和特异性，同时可用于商业样本及复杂食物样本的检测，有望用于发展中国家和基层实验室开展动物源性成分的快速检测。另外，该方案可以根据其他物种特异基因进行修改，建立不同动物成分的PCR-电泳检测技术，在肉及其制品的掺假、溯源中发挥重要的作用。

图1 猪源性成分特异性结果

图2 猪源性成分灵敏性结果

表1 肉制品中猪源性成分的检出结果

[1]王海鹏.17.5吨假牛肉全是用猪肉做的 [N].西安晚报,2013-9-12(08).

[2]王瑞元,巢强国,葛宇,等.奶糖中猪成分明胶PCR鉴定方法的研究[J].食品工业,2010(1)：86-88.

[3]李巧玲，刘景艳.市场鲜猪肉掺假状况的调查监测[J].食品科学，2004，25（10）：273-276.

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[5]李家鹏，乔晓玲，田寒友，等.食品和饲料中动物源性成分检测技术研究进展[J].食品科学.

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[14]薛超波，王萍亚，李素芳，等.基于 PCR多物种鉴定技术及其在肉类鉴定中的应用 ［J］.食品安全质量检测学报，2016，7（2）：562-566.