牛奶中β内酰胺类抗生素残留检测技术研究进展

王淑婷,孙晓亮,曹旭敏,王晓茵,王玉东，赵思俊*

(1.中国动物卫生与流行病学中心,山东青岛 266032；2.农业部畜禽产品质量安全风险评估实验室(青岛),山东青岛 266032)

β内酰胺类抗生素(β-lactam antibiotics)是指化学结构中含有β内酰胺环的一类抗生素，这是一种通过抑制胞壁黏肽合成酶，对细菌胞壁进行破坏，从而导致细菌发生膨胀裂解的药物[1]。它主要包括青霉素类和头孢菌素类，这些药物具有很强的杀菌活性，兼具毒性较低、适应症广等许多优点。在动物生产中，其经常被用于治疗动物呼吸道、尿道、肠胃系统等感染，也用于治疗奶牛乳房炎等[2]。但是由于许多饲养者不能按照正常的要求使用，或不遵守休药期规定等原因，造成动物体内会残留有一定量的β内酰胺类抗生素，从而间接地危害人类身体健康。这些残留的抗生素会使得部分人产生一些过敏反应，有些甚至会使人体产生严重的耐药性，引起食源性污染和二重污染，造成中毒反应、致畸形和致残等一系列危害[3]。β内酰胺类药物在牛奶中被检测出的概率较大[4]。

在药物残留分析检测的过程中，样品的前期处理非常重要，处理得当可以提高对样品分析的准确性，也是整个检测过程中最可能出现误差的环节。因此，为了可以精确测出β内酰胺类药物的残留，对牛奶中药物残留实现准确监管，需要进行有效的前期处理。不仅如此，为达到精确测量，还需要选择合理的检测方法。其中国内外对于β内酰胺类药物分析检测的研究已经很多了，其中按照检测目的分类可以分为筛选法和确证检测法。确证检测法对检测仪器的精密性要求非常高，其中液相色谱法、毛细管电泳法、液-质联用法等技术都属于确证检测法，而微生物法和免疫分析法属于筛选法。

1 牛奶中β内酰胺类药物残留样品前处理技术

1.1 样品提取

为了将样品中的目标溶解物分离，需要根据药物的理化性质、实验环境、样品种类分别提取。β内酰胺类药是一种极性或中等极性的化合物，可以利用碱性、酸性溶液，或是乙腈、甲醇等极性溶剂提取。很多有关动物源性食品中存在的β内酰胺类药物残留分析中，通常采用乙腈[5]、乙腈-水[6]、酸化乙腈[7]、酸化甲醇等溶剂进行提取。因为考虑到动物组织中一些大分子化合物可以与β内酰胺类药物发生反应，形成共价键，因此还需要加入硫酸、钨酸钠等物质。

由于β内酰胺环在很多药物结构中不太稳定，在酸性溶液中非常容易发生降解反应，因此酸性有机溶液仅可用于提取氨苄西林等稳定性较好的药物。而甲醇、乙腈等有机溶剂可以很好的进行脱脂和脱蛋白反应，其中周昱等[5]用乙腈为提取剂对牛奶中头孢尼西药物进行提取处理，然后将处理后的溶液进行高效液相色谱串联质谱检测，药物的回收率为87.4%～93.5%。由于受到β内酰胺药物的稳定性影响，对于无机溶剂的提取液还需要进行pH的调节，实验操作复杂，在蛋白沉淀方面效果较差，因此无机试剂在应用领域不如有机溶剂广泛。

1.2 样品净化

由于采集到的样品存在很多杂质，这些杂质通常会增加基线噪声，对检测器、柱效等有很大干扰，对仪器的色谱柱产生污染，导致产生色谱管路阻塞等问题，因此在样品提取后需要对试样进行净化操作。在目前主流的处理方法中固相萃取(solid-phase extraction，SPE)和液-液萃取(liquid-liquid extraction，LLE)最为常见，而分子印迹技术、固相分散技术等方法使用范围较窄。

1.2.1 液-液萃取法 液-液萃取法(LLE)是一种非常简单、传统的净化方法。这种方法操作简单，对试验条件要求不高，是净化试样最为常见的方法。Dasenaki M E等[8]用液-液萃取的方法成功提取了鱼类、乳制品中包括头孢菌素类药物在内约143种药品的残留物，同时用四级杆-飞行时间串联质谱法进行了准确的筛查。首先在样品中加入1 g/L的乙二胺四乙酸和1 mL/L甲酸水溶液，在对溶液进行均匀混合后，离心后静置于-20℃的环境中12 h以上，用来获得分离出的上层溶液，实现脱脂和去除蛋白质，达到溶液的净化。在国内的研究中，肖惠贞等[9]用HPLC-MS/MS检测方法，在经过纯水超声提取样品后，用乙腈对蛋白进行沉淀，实现对青霉素类药物及其代谢物的提取检测。HPLC-MS/MS方法的检测结果表明，乳制品中的12种β内酰胺类药物的回收率可以达到80.0%～110.0%，药品的检出限在0.03 μg/kg～0.15 μg/kg之间。但是上述方法均采用大量的有机溶剂，而且操作非常繁琐，同时试验结果重复性较差，不利于多次试验，且容易产生乳化现象。因此，液-液萃取方法已经正逐步被SPE方法所代替。

1.2.2 固相萃取法 固相萃取法(SPE)是基于液-固色谱理论，其中的固体吸附剂吸附液体样品中的目标化合物，从而达到与样品基体及其他干扰物质分离，然后再用洗脱液洗脱或加热解吸附，实现目标物质的富集的一种方法。目前,固相萃取柱已经商品化，主要包括C18柱、混合型离子柱、强阳离子柱和亲水亲酯柱等。

SPE柱要根据被测药物的性质和种类进行选择，通过试验进行筛选。Dorival G N等[10]对牛奶中经常存在的14种β内酰胺类药物进行了超高效液相色谱串联质谱法分析，样品经乙腈/甲醇/Mc Ilvaine缓冲液(V/V/V:60/25/15)提取后再进行PSA固相萃取柱净化操作，随后在高精度仪器的辅助下进行检测。该法中β内酰胺类药物定量限低至0.3 μg/kg～2.0 μg/kg，回收率高达96.0%～104.5%。王宏伟等[11]在测定牛奶中14种β内酰胺类抗生素残留检测中，用乙腈进行样品提取后，经预处理的HLB柱净化后，用乙腈洗脱，平均回收率为70%～110%。孙涛等[12]建立了检测生鲜乳中14种β内酰胺类抗生素的SPE-UPLC-MS/MS方法，方法回收率为70.1%～95.5%，检出限为0.1 μg/kg ～0.6 μg/kg，定量限为0.3 μg/kg～1.8 μg/kg，应用Oaiss Prime HLB固相萃取柱，无需活化、淋洗和洗脱的步骤，直接过滤净化，大大提高了样品前处理的速度。

固相萃取过程中，对有机溶剂的用量要求不高，也不容易产生乳化现象，因此这种方式可以更好、更容易的进行定量萃取来自乳制品中β内酰胺类抗生素的痕量残留。国内外学者对固相萃取技术的研究上有了长足的发展，其中微萃取技术应用最为广泛。这种方法用萃取相间与待测液体的非均相平衡关系，使待测组分扩散吸附到石英纤维外部的涂层，进行进一步的仪器分析。这种方法相比SPE，它可以完成更大的萃取面积和固定薄膜，实现更好的聚集作用。Yahaya N等[13]用HPLC方法和固相微萃取技术对牛奶中3种不同的青霉素药物进行分析，以一种有序介孔碳COU-2为吸附剂，同时在萃取过程中对溶液的盐加入量、pH、萃取时间、解析时间、洗脱溶剂和吸附剂量等影响因素进行了进一步优化，将试验的的回收率提高到80.3%～99.5%，定量限可达2.0 μg/L～3.3 μg/L。

1.2.3 基质固相分散技术 基质固相分散技术的预处理是将适量的填料与基质进行混合研磨，使得样品与填料表面可以充分的接触，得到半同态的混合物并将其作为填料装柱，然后采用不同的溶剂淋洗、洗脱柱子，富集待测物。为了达到最优萃取结果，需要对分散剂种类、样品与分散剂比例及洗脱剂等进行优化[14]。王炼等[15]用MSPD方法先对牛奶样品进行了净化，然后使用HPLC-MS/MS方法对牛奶中的20多种残留药物(含4种头孢类药物)进行分析。在试验中，将2g C18与样品进行充分的研磨后，进行装柱，用甲醇溶剂进行洗脱，回收率在71.2%～95.3%之间。这样的处理方法，效率更高，测试便捷，但是相比于其他的萃取方法来说，这种萃取方式效率偏低。

1.2.4 分子印迹技术 分子印迹技术是用待测物体为分子模板，采用非共价键或共价键结合的聚合物单体进行交联，然后将模板分子从聚合物中提取出来，聚合物内部就留下了模板分子的印迹，可以选择性地提高待测物在高分子材料上的吸附性。王萍等[16]选择分子印迹聚合物为固相萃取柱填料对牛奶中的3种青霉素类药物进行回收试验，提取后的液体，经过HPLC检测，可以发现分子印迹技术的回收率为83.5%～87.3%。这个净化方法在预定、识别、实用等方面有很大优势，但是由于较难得到分离介质要求的分离纯品或价格昂贵而增加了试验的成本。

除此之外，张秀尧等[17]使用超滤离心法，先用乙腈对牛奶中β内酰胺类药物进行提取，提取液经超滤管离心净化处理，通过超高效液相色谱-三重四极杆质谱快速测定牛奶中53种β内酰胺类抗生素及其代谢产物的残留量。相关系数均高于0.991 1，平均加标回收率在71%～121%之间，相对标准偏差为1.7%～19%。因此这种方法的操作非常简单、便捷，大大节省了前处理时间，且回收效果好，但由于其试验成本依然较高，不利于大范围推广。

2 牛奶中β内酰胺类药物残留检测方法

2.1 液相色谱法及液质联用法

高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)是在经典色谱基础上发展起来的，在高压下的流动过程获得的色谱过程，可以实现好的选择性分离、高效分离，具备检测灵敏度高、准确性高等优点。许娜等[18]应用HPLC-UV方法在进行样品的有机滤膜净化后，用1 mL/L甲酸溶液和甲醇溶液进行等浓度洗脱，得到的液体，通过254 nm波长的色谱分析，回收率达90%～105%，检出限为1.0 μg/L。多数的β内酰胺类抗生素由于缺乏特征性的紫外吸收性质，一般采用的DAD、UVD、FLD等检测方法需进行衍生化处理。但这种方法增加了测样的难度，约束了对样品处理方法的进一步改进。

液相色谱-质谱联用(liquid chromatography with mass spectrometry，LC-MS )技术同时具备液相色谱卓越的分离能力与质谱可靠的定性信息，LC-MS技术已逐渐从单级质谱发展到串联质谱(LC-MS/MS)。Baeza A N等[19]建立了牛奶中头孢菌素类药物的LC-MS/MS检测方法，方法的定量限远远低于药物最高残留限量。

随着近年来HPLC的不断发展，出现了超高效液相色谱技术(ultra performance liquid chromatography，UPLC)，UPLC与MS/MS的联用使得生物组织中β内酰胺类药物多残留的检测在种类和数量上有了进一步的发展。李琴等[7]用UPLC-MS/MS法检测牛奶中45种β内酰胺类抗生素，以1 mL/L甲酸水(含100 mL/L甲醇)/乙腈(含100 mL/L甲醇)为流动相，所有药物选用ESI+进行检测，回收率为62.1%～118%。Junza A等[20]建立了同时测定牛奶中β内酰胺类及喹诺酮类兽药残留的UPLC-MS/MS方法，该方法检出限低至4.1 μg/kg～104.8 μg/kg，定量限达4.2 μg/kg～109.7 μg/kg，检测方法令人满意。随着UPLC的使用，色谱的分离能力和药物的分析速度有了极大的提高，而通过与UPLC等众多分离技术的联用，MS/MS检测器已具有高通量的分析能力，能够提供检测物详细的分子质量与结构信息，使得UPLC-MS/MS法在化学品的定性和定量检测中具有独特的优势，其快速、高灵敏度及高精确的检测特性使得近年来其在药物分析、食品检测等领域中发展迅速。

2.2 毛细管电泳法

毛细管电泳(capillary electrophoresis，CE)或称为高效毛细管电泳(high performance capillary electrophoresis，HPCE)，是用高压电磁场为驱动力，通过毛细管分离管道，根据样品的电泳强度和分配差异实现液相分离的一种技术。左艳丽[21]用上述方法对头孢菌素等抗生素进行检测，并建立了毛细管带电泳法同时测定头孢曲松钠和左氧氟沙星含量的检测方法，平均回收率为99.15%。但该方法由于电渗流不稳定的原因，导致了结果重现性差的问题，因此也限制了其在残留分析的应用。

2.3 免疫分析法

免疫分析法是用抗原、抗体的特异性识别及结合反应的原理建立起的进行样品检测的物质分析方式，这种方法检测效率高、检测灵敏、操作简单，在β内酰胺类药物的检测中进行批量快速检测或是现场快速检验较为合适。β内酰胺类药物的免疫分析法主要包括了放射免疫分析法、酶联免疫试验等。Broto M等[22]用了酶联免疫吸附法对牛奶进行青霉素类药物残留检测分析，这种方法的检出限为0.1 μg/L，远远低于药物的最高残留限量。但是免疫分析法也存在着一些缺点，如检测结果受杂质影响存在着假阳或假阴的情况。同时由于反应的特异性，一次试验只能检测一种药物，这需要制备多种抗体，又大大增加了技术成本。

2.4 微生物检测法

微生物检测法(microbial inhibition test，MIT)也就是俗称的微生物抑制性试验，是一种利用对微生物生理机能和代谢进行抑制的作用来对药物残留进行定性或定量的检测方法[23]，包括纸片法、氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)法和试管扩散法及四甲基偶氮唑盐(thiazolyl blue tetrazolium bromide,MTT)法等。李延华等[24]用BSDA法、国标TTC法和试管扩散法对牛奶中β内酰胺类药物残留的检测结果进行了对比研究，BSDA法对6种β内酰胺类药物的检测限均在欧盟规定的MRLs浓度范围内，但检测时间长，操作繁琐；而TTC法对药物的检出限远远超出欧盟规定的MRLs浓度范围，不符合国际要求；试管扩散法在检测时间、操作难易程度方面较BSDA法及TTC法具有一定的优越性。该法简便易行、经济省时同时检测限较低，可补充BSDA法及TTC法的不足，应用于检测牛奶中β内酰胺类抗生素的残留。

3 结语

β内酰胺类药物在牛奶中的残留报道最多。前处理过程在样品提取方面，有机试剂的应用广泛。在样品净化方面，固相萃取技术相较于液液萃取技术、基质固相分散技术和分子印迹技术不仅更有效，而且更容易实现自动、快速、定量萃取，应用广泛，具有广阔的发展前景，超滤离心技术作为新兴技术，较于固相萃取技术大大简化了操作步骤，节省了前处理时间，提高了工作效率，但由于其成本较高，大范围推广还较为困难。在检测方法上，由于微生物法成本低、操作简单的优势，是乳制品工厂检测抗生素残留的主要筛选分析方法。LC-MS/MS能够准确提供更详细的分子质量与结构信息，具有更高的选择性和精确度，已成为检测牛奶中痕量β内酰胺类药物残留的首选确证方法，应用广泛。目前由于β内酰胺酶[25]的滥用及体内代谢等原因，导致原形药物发生酶解，影响了对原形药物的检测，现已有许多研究者开展了关于头孢类药物在动物体内代谢物解析的工作，但目前关于牛奶中多种β内酰胺类药物及其代谢物残留同时检测的报道仍然较少[26-27]。为以后能更有效地监管牛奶中β内酰胺类药物的残留，研究者应致力于尽快建立起对原形药物及其相应代谢物的快速检测技术。