噬菌体发酵工艺的影响因素

庄盈婷，孙虎芝，潘 强，王佳存，刘 爽，刘广芹，刘 慧，任慧英,2*

(1.青岛诺安百特生物技术有限公司，山东青岛 266000；2．青岛农业大学动物医学院，山东青岛 266109)

目前，随着抗生素的大量和不合理的使用，人类和动物源性的致病菌逐渐产生耐药性，超级细菌等多重耐药细菌的出现，使得细菌耐药性问题成为现代医学和兽医学面临的最主要问题[1-3]。2016年英国《全球抗生素耐药回顾》中指出，目前中国抗生素的用量约占世界抗生素用量的一半，如不采取措施，到2050年，抗生素耐药每年将导致100万人早死。寻找安全、绿色、有效的抗菌剂成为解决抗生素耐药问题的主要方案。

噬菌体是细菌、真菌、放线菌等微生物的天敌，广泛存在于自然界中，数量巨大，种类繁多，是目前理想的天然抗菌剂[4]。随着噬菌体治疗的优势被广泛认识，越来越多的研究也集中到了噬菌体的产品开发中，噬菌体的产业化无疑是噬菌体治疗的助推器。2006年8月18日美国FDA批准了用于肉类防腐的第一个噬菌体产品。2007年，美国USDA农业部上市了针对大肠埃希菌O157的噬菌体制剂。韩国iNtRON公司成功研制了在鸡饲料中添加的噬菌体[5]。越来越多的噬菌体制成产品应用于食品、药品等行业。

噬菌体产品在食品药品行业中发挥着越来越重要的作用，随着噬菌体产业化的推进，噬菌体的需求量也越来越高，噬菌体的大规模生产是噬菌体产品的必须条件，摸索高效的噬菌体发酵工艺也是降低噬菌体产品成本的重要措施。目前对噬菌体的研究主要集中在生物学特性、基因组学及蛋白质组学方面，对噬菌体生产发酵参数和规模化生产的制备条件等研究较少[6-8]。本文参考国内外噬菌体发酵的方法和改进措施，总结影响噬菌体发酵的主要因素和相应参数，为噬菌体的工业化生产提供科学依据。

1 影响噬菌体发酵工艺的主要因素

微生物发酵主要是通过严格控制各种发酵条件，从而实现微生物大量增殖的过程。微生物发酵已广泛应用于食品、药品和化工产品的生产中，针对微生物发酵条件的研究已经相当深入[9]。噬菌体发酵作为微生物发酵中的一种，影响其发酵工艺的主要因素与一般的微生物发酵有很多相同之处，例如pH、温度、溶氧等基本条件。但噬菌体作为一种细菌病毒，其发酵条件与普通的细菌发酵条件也有很多的不同之处，例如宿主菌的选择、最佳感染复数等。

1.1 噬菌体和宿主菌对噬菌体发酵的影响

提高噬菌体发酵的效价应选择高效价增值的噬菌体和宿主菌。噬菌体的增殖需要在宿主菌中进行，所以噬菌体的发酵在一定程度上依赖宿主菌的发酵，选择适宜发酵的宿主菌和噬菌体是噬菌体工业生产的基础[10]。Merabishvili M等[11]研究发现，并不是所有的噬菌体都能大量生产，当噬菌体的产量增加时，25个噬菌体中会有2个噬菌体因为收缩性而受到限制，不能继续增殖。另外，大量研究发现同一噬菌体对不同宿主菌在相同的条件下的结合效率是不同的。噬菌体通过识别宿主菌的表面受体完成吸附，进入不同宿主细胞的噬菌体，在不同宿主菌细胞内酶的作用下其增殖的效率是不同的[12]。选择高效价增殖的宿主菌往往是提高噬菌体发酵的关键。

1.2 感染复数对噬菌体发酵的影响

感染复数是指作用的噬菌体与感染的宿主菌的数量比例，最佳感染复数是指获得最高噬菌体效价的噬菌体与宿主菌数量比例。研究发现，噬菌体发酵按照最佳感染复数比例接种，能获得稳定的最高噬菌体效价[13]。Zhang C等[14]在对大肠埃希菌噬菌体生物学特性的研究中，噬菌体在按照最佳感染复数接种后，获得最高的噬菌体效价。李梦哲[15]研究也发现，在噬菌体增殖的过程中并非接种的噬菌体的数量越多越好，在适宜的宿主菌和噬菌体的比例下更利于噬菌体的增殖。感染复数是研究病毒感染和产出之间量效关系的重要生物学指标，而最佳感染复数在经济有效地获取最大量的噬菌体产出中发挥关键性作用。

1.3 培养基对噬菌体发酵的影响

噬菌体的发酵培养基并非营养物质越丰富越好。发酵培养基的成分作为宿主菌和噬菌体的主要能源，是噬菌体发酵中的关键影响因素，如果发酵培养基的营养供给不足，会导致宿主菌生产缓慢，进而影响噬菌体的增殖，且如果没有足够的能量供给，噬菌体也无法完成吸附和释放等过程[16]。但Heilmann S等[17]指出当宿主菌处于饥饿状态时，能产生高效的噬菌体感染。这一结论也在Grieco S H等[18]的试验中等到了证实，使用富含营养的培养基，却得到了32%的噬菌体产量。所以在噬菌体发酵过程中，并非发酵培养基的营养物质越丰富越好。

噬菌体发酵培养基中添加一定浓度的抗生素可以提高噬菌体的发酵效价。Krisch H M等[19]研究发现，噬菌体发酵滴度的升高与低水平的抗生素特别是β内酰胺和喹诺酮类抗生素之间存在协同作用。针对3种T型噬菌体(T4，RB33和RB49)进行研究，在各自噬菌体发酵中分别添加0.003 μg/mL或0.03 μg/mL β内酰胺抗生素(CTX)。T4噬菌体在添加0.003 μg/mL的CTX后，发酵产量比没有添加CTX的对照组提高了10倍；RB33和RB49噬菌体在添加0.03 μg/mL的CTX后，发酵产量比对照组分别提高了10倍和5倍。目前，大肠埃希菌与肌尾噬菌体之间、耶尔森菌和长尾噬菌体之间，均已建立了噬菌体产量与抗生素之间的协同作用。这种药物介导噬菌体繁殖产量提升的机制，可能与宿主菌受到药物抑制后细胞形态发生变化有关。宿主菌细胞在受到抗生素抑制后，体积变大且产生长脂肪细丝，该受到抑制状态下的宿主菌更易于噬菌体的增殖。因此，推断噬菌体增殖的最佳条件可能不是人们普遍认为的指数生长期的宿主菌，而是受到抑制的宿主菌的数量。

1.4 离子对噬菌体发酵的影响

噬菌体发酵过程中添加离子可以影响噬菌体的发酵效价，二价阳离子可以通过降低排斥力并通过中和宿主细胞表面聚合物与噬菌体表面之间的电荷影响噬菌体的初次附着，在噬菌体感染周期的不同阶段发挥重要作用[20]。每个噬菌体对于特定的二价阳离子具有其自身的特异性。 Chhibber S等[21]研究金属离子在MRSA噬菌体增殖和产量中的作用时发现，5 mmol/L CaCl2显著提高了噬菌体的发酵产量，并有效缩短了噬菌体的吸附时间。作用机理主要是培养基中钙离子可以中和宿主细胞表面聚合物与噬菌体表面之间的电荷，降低排斥力，促进噬菌体MR-10的初次附着。而习羽[22]在研究二价阳离子对一株烈性乳杆菌噬菌体吸附的影响时发现，在吸附45 min后，加Ca2+的试验组可达到96.22%的吸附率，空白试验组为63.78%，而加Mg2+的试验组只有19.5%，钙离子显著提高了乳杆菌噬菌体的吸附能力，而镁离子抑制了乳杆菌噬菌体的吸附。

1.5 pH对噬菌体发酵的影响。

噬菌体的发酵pH一般为中性，pH偏高或偏低都会对噬菌体的发酵产生很大影响，适宜的pH发酵条件可以获得高效价的噬菌体发酵产物。噬菌体的发酵环境是影响噬菌体发酵的主要因素，培养基的pH会对噬菌体及其宿主菌的生长造成很大的影响，pH的变化会导致培养基中离子浓度的变化，在一定程度上会影响噬菌体的吸附，从而影响噬菌体的增殖[23]。张志平等[24]在荧光假单胞菌噬菌体的研究中发现，该噬菌体的最佳感染pH 在7.5～8.0之间，超出此pH范围，噬菌体的增殖受到了明显的抑制。不仅不同的pH会影响噬菌体的增殖，在发酵过程中调控pH与不调控pH，对噬菌体发酵的最终效价也会产生很大的影响。Grieco发现，与发酵过程中不调控pH的噬菌体发酵相比，调控pH保持在7.4进行的发酵噬菌体产量增加了165%，高于没有任何pH控制的水平。因此，在发酵过程中控制pH可以显著提高噬菌体的发酵产量[18]。

另外。噬菌体发酵过程中对温度、溶氧和转速的控制也是非常重要的发酵参数，温度会影响宿主菌和噬菌体内的酶发挥作用，选择宿主菌和噬菌体最适的生长温度，可以有效提高噬菌体发酵的最终产量。溶氧和转速主要控制噬菌体发酵过程中的溶氧和培养基均匀度，摸索不同噬菌体的最适溶氧和转速，可以保证噬菌体的能量供应，获得较高的噬菌体产量。

2 总结与展望

细菌的耐药性问题已经成为当今医学和兽医学的主要问题，2016年G20峰会，细菌的耐药性威胁被写进公告，2016年我国农业部2428号公告决定停止硫酸黏杆菌素用于动物促生长。噬菌体作为新一代抗菌剂的代表，其作用效果已经被证实，目前噬菌体已经被批准用于铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、单核细胞增生李斯特菌、肠炎沙门菌等多种细菌的控制中。美国和欧洲等国家也批准了噬菌体产品的上市。噬菌体产品以其绿色、安全、有效的优势，成为适合解决细菌耐药性问题的重要选择。

噬菌体的发酵是噬菌体产品工业化的关键，本文综述了目前研究发现的影响噬菌体发酵的主要因素，其中噬菌体和宿主菌、最佳MOI、培养基、离子和pH是影响噬菌体发酵的主要因素，另外，温度、溶氧和转速也是影响噬菌体发酵的重要因素。因此，噬菌体的发酵可以从上述方面进行摸索和研究，获得适宜工业化生产的噬菌体发酵条件。

目前对噬菌体发酵的研究还较少，对影响噬菌体发酵条件的原理研究也较少。随着噬菌体应用越来越广泛，噬菌体的需求量会越来越多，噬菌体的大规模生产已成必然之势，因此，针对噬菌体发酵条件的摸索还要继续深入。比如，针对影响噬菌体发酵的因素进行原理的研究及条件的优化，针对不同的致病菌开发不同的噬菌体发酵工艺，研究不同噬菌体如肌尾噬菌体、长尾噬菌体和短尾噬菌体等的发酵工艺，对噬菌体发酵中的安全问题进行研究等，这都是下一步研究需要解决的问题。