丙型肝炎病毒对ISG产物及干扰素的影响研究进展

王悦萦，马 鹏，李林杰，常秋燕，郭富城，李凌浩，马晓霞，马忠仁

（西北民族大学生命科学与工程学院／西北民族大学甘肃省动物细胞工程技术研究中心，甘肃兰州730030)

在对病毒感染产生免疫应答时，哺乳动物细胞内的信号通路能够导致多种细胞内事件的发生，使感染细胞直接产生抗病毒反应，即“抵抗病毒感染的天然免疫应答”，这是抵抗病毒的第一道免疫防线。当受感染的细胞识别入侵病毒的分子标签，即病原相关分子模式 (pathogen-associated molecular patterns，PAMP) 时，便可诱发天然免疫反应。Toll样受体 (Toll-like receptors,TLRs) 和RIG-Ⅰ样受体 (RIG-Ⅰ like receptors,RLRs) 为宿主细胞识别病毒的两种重要模式受体(pattern recognition receptors,PRRs)。前者在细胞膜上，后者在胞浆中，从而识别通过不同途径产生的病毒核酸，并通过招募特异接头蛋白，激活一系列信号级联反应，引发Ⅰ型干扰素和促炎症细胞因子的产生。RNA病毒能够通过TLR3和TLR4以及RLR诱导Ⅰ型干扰素的产生[1]。在某种程度上，TLR3在抑制丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)复制的过程中所发挥的作用要强于TLR4[2]。HCV等正链RNA病毒侵染靶细胞后，能够对细胞的膜生发结构进行利于自身自带病毒产生的形式进行物质重排，从而将脂类合成系统为病毒所用[3]。此外，由于HCV感染而导致的肝硬化会进一步诱导免疫系统通过产生诸如IL-6和IL-23等炎性因子来对纤维化的病灶进行清除，从而进一步对肝脏进行损伤[4]。细胞的自噬过程与天然免疫之间的交流对于机体抗击HCV感染也是至关重要的[5]。近年来，针对HCV感染的免疫遗传研究为从宏观上把握HCV与宿主免疫系统之间的“斗争”开启了一条新的道路[6]。

利用RNA相关的PAMP作为一种分子工具为研究者展示了被感染的肝细胞中PAMP RNA/RIG-Ⅰ结合信号可激活各种转录因子并导致调控天然免疫应答基因的即时表达[7]。在应答病毒感染的反应中可触发干扰素调节因子3(IRF-3)和核转录因子κB(NF-κB)的激活，通过IPS-1蛋白进行信号传导，经RIG-Ⅰ识别细胞内的HCV PAMP，激活下游信号通路来对HCV进行抗击。IPS-1信号将导致IRF-3和NF-κB的激活和核易位。在树突状细胞亚群和巨噬细胞等特定类型的细胞中，IRF-5和IRF-7等其他IRF家族成员是抵抗病毒感染的天然免疫应答的重要组成部分。病毒诱导的信号转导能够激活转录激活因子Ⅱ，并能够进一步指导染色质的重塑，有助于病毒触发的IFN-β启动子上增强体的建立。IFN-β增强体包括IRF-3和NF-κB，它们能够产生使感染细胞上发生IFN-β的转录反应。NF-κB的活化功能在趋化因子和炎性细胞因子对病毒感染的应答反应过程中非常重要，它能与干扰素一同调节后续的适应性免疫反应。

1 干扰素诱导基因产物的抗病毒作用

干扰素诱导基因(interferon stimulated gene,ISG)产物可以直接调节病毒复制、免疫防御、宿主代谢、基因表达、细胞凋亡等细胞内行为。就HCV而言，干扰素刺激基因能够通过抑制病毒蛋白的合成来破坏病毒的复制，其中包括抑制病毒负链中间产物的复制、抑制RNA加工等。干扰素主要通过旁分泌途径，从受感染的细胞分泌到局部组织从而诱导广谱免疫应答，进而阻断病毒在细胞之间的传播。IRF-3及NF-κB通过与受感染细胞的IFN相关受体结合，分别调控IFN-β的自分泌和旁分泌信号通路来实现感染细胞与未感染细胞对HCV的抗感染能力。这个过程可导致Jak-STAT途径的激活。与受体相关的Jak和Tyk1蛋白激酶的磷酸化信号转导，进而活化转录蛋白信号传导及转录激活因子(signal transducers and activators of transcription，STAT)上的丝氨酸和酪氨酸残基能够使STAT活化，进而使STAT与IRF-9关联，ISGF3转录因子复合物适应了细胞核。ISGF3是关键的转录因子，它通过ISG的启动子/增强子区域结合干扰素，使干扰素刺激应答元件(interferon-stimulated response element,ISRE)促进干扰素刺激基因的高水平表达。干扰素通过病毒感染和干扰素刺激基因的表达的过程，结合IFN-α/β受体和Jak-STAT信号通路引起了第二次转录活性。最新研究表明，HCV感染细胞后会产生一种被称为NLRX1的宿主源性病毒前体可以通过召集Poly(c)-结合蛋白2(poly(c)-bindingproteins 2,PCBPs)分子从而与线粒体抗病毒信号蛋白(mitochondria antiviral signaling protein,MAVS)蛋白结合，由此来抑制干扰素信号通路的信号传递，从而抑制干扰素的抗病毒作用[8]。研究表明，核糖核酸酶L(RNA酶L)将病毒或自身RNA加工成RIG-Ⅰ信号的小RNA配体，这决定了病毒扩增的多少。IRF-7是一种ISG，它在肝脏中的表达类型属于干扰素依赖型。IRF-7能够促进多种IFN亚型的表达，其中IFN-α的分泌会启动进一步的信号转导从而延长干扰素的产生时间[9]。治疗HCV感染的干扰素疗法就是利用了IFN-α能够抑制HCV的复制和扩散的能力。IFN-α以及β防御素(β-defensin)在细胞中通过间接调节细胞的适应性免疫来增强其他炎性细胞因子的产生，从而有效干扰HCV在细胞中的正常复制活性[10]。因此，病毒引起和调控的天然免疫应答将会影响HCV RNA的复制和感染力。

2 与HCV感染相关的先天免疫应答

在HCV RNA复制、病毒颗粒对细胞的侵染以及病毒蛋白表达的细胞培养模型向我们展示出HCV启动和控制天然免疫反应的一些蛛丝马迹。当感染了HCV后，由于治疗的延误而转变成了持续性感染，则极大可能是受感染的肝脏发生癌变[11]，而边缘区淋巴瘤及弥漫性B细胞淋巴瘤与HCV感染是密切相关的[12]。研究表明，当把HCV引入人肝癌细胞时，HCV基因组或其亚基因组RNA的特异性片段均可引起IFN-β的形成和表达。HCV非编码区可形成一系列高度保守的茎环RNA(dsRNA)结构以及含有胞嘧啶的具有可变长度的多聚尿苷区域 (poly-U/UC)，可作为PAMP受体可识别并结合病毒序列，进而激活宿主的免疫防御。

通过对Huh7衍生的(人肝癌)细胞系(也被称为Huh7.5)的研究，获得了HCV RNA PAMP受体的主要特征，被丙型肝炎病毒感染或被丙型肝炎病毒RNA转染的Huh7.5细胞系不但不发生细胞内的天然免疫反应，而且还允许丙型肝炎病毒的感染和HCV RNA的复制。研究鉴定出RIG-Ⅰ作为HCV的RNA PAMP受体，能够结合HCV的dsRNA序列，从而激活IRF-3和NF-κB信号并诱导IFN-β的表达和天然免疫应答的发生。RIG-Ⅰ通过干扰素刺激基因(如ISG56等)的表达可以抑制丙型肝炎病毒RNA的复制。由于RIG-Ⅰ CARD的点突变能够阻遏下游IRF-3的磷酸化和NF-κB的激活，所以Huh7.5细胞可允许丙型肝炎病毒感染和HCV RNA复制。病毒可通过诱导RIG-Ⅰ信号引发宿主的免疫反应，从而影响HCV感染的结果[13]。TLR3是一种双链RNA PAMP受体，它与dsRNA PAMP配体结合后给宿主发出信号。TLR3信号通过髓样分化因子(myeloid differentiation factor 88,MyD88)非依赖性过程激活IRF-3和NF-κB，此过程所需的β干扰素Toll样受体结构域衔接蛋白(Toll/IL-1 receptor domain containing adaptor inducing IFN-β，TRIF)结构域。虽然在自然感染HCV的过程中TLR3的作用尚不清晰，但在相关遗传和生化研究中已经确定了RIG-Ⅰ可发挥的显著作用，并表明了肝细胞中TLR3信号通路可在先天免疫应答对病毒感染的应答反应中发挥作用[14]。

病毒的非结构蛋白也可刺激先天免疫反应，对HCV感染进行防御。HCV NS5A蛋白的表达能够诱导细胞产生应激信号通路从而激活STAT3。这种信号通路的激活方式和IFN-α/β受体信号的转导相类似，STAT3能够通过JAK-STAT信号通路促进基因的表达[15]。研究证实，HCV的核心蛋白能够激活双链RNA依赖蛋白激酶R(protein kinase R,PKR)的活性，此外PKR与双链RNA结合后活化，可导致真核起始因子磷酸化并抑制局部蛋白的合成。活化的PKR也可调节NF-κB结合DNA的活性，诱导IRF-1发挥其转录功能。病毒RNA的5′ 非编码区能够结合核心蛋白，为所需激酶提供PKR并激活双链RNA的PAMP，这是HCV核心蛋白可以激活PKR的最主要原因。细胞与病毒粒子的相互作用也可诱导干扰素的产生。HCV的颗粒样病毒与树突状细胞结合也可介导细胞对病毒粒子的摄取和树突状细胞的活化。因为在病毒感染阶段，IFN产生的主要来源是树突状细胞亚群，所以HCV可以通过局部调控或系统影响干扰素的表达水平，来实现对树突状细胞功能的调节。

3 HCV对干扰素上游信号的影响

HCV在感染细胞中通过自身的一些非结构蛋白(NS2、NS3、NS3/4A、NS4B和NS5A)来实现对机体免疫监控的逃避[16]。科研人员已经开展针对NS3病毒蛋白药物的相关研究，从而达到提高干扰素抗病毒的治疗效果[17]。虽然HCV感染急性期血清中的IFN-λ在抗击病毒感染进程中发挥了很重要的作用[18]，但是抗击HCV急性感染的主力军仍然是Ⅰ型IFN。HCV与宿主相互作用的一系列研究揭示了PAMP信号通路可激活IRF-3，也可以转导IFN-α/β受体信号，ISG效应分子可以作为逃避和控制宿主反应的主要结合位点。现已鉴定出HCV的NS3/4A蛋白酶是病毒诱导IRF-3活化和诱导IFN-β表达的拮抗剂[19]。经由HCV感染的RNA、经内源性复制的HCV RNA和含有隐性HCV基因组RNA的外源性细胞病毒感染，都可引发NS3/4A蛋白酶阻遏激活IRF-3的RIG-Ⅰ信号的反应。由于NS3/4A蛋白复合物可定向裂解来自细胞膜的IPS-1，这将有助于阻断IRF-3信号通路，进而减弱RIG-Ⅰ信号。该调控最终导致了IPS-1的水解作用，并防止了病毒诱导IRF-3磷酸化，从而使IRF-3在HCV感染的细胞中保持无活性的状态。HCV的NS3蛋白具有两种酶学活性，在其氨基末端结构域内可编码一种丝氨酸蛋白酶，在其羧基末端结构域内可编码一种RNA解旋酶[20]。然而，NS3/4A复合体是构成病毒蛋白酶的重要组分，在病毒复制过程中它能从HCV的多聚蛋白中释放出非结构蛋白。虽然NS3的解旋酶活性并不是调控IRF-3活化所必需的，但NS3/4A蛋白酶活性是IPS-1水解所必需的。研究表明，NS3/4A可通过IPS-1水解作用调节RIG-Ⅰ的信号通路，这与NS3/4A可指导阻断IRF-3的磷酸化有密切关系，同时这也是HCV持续性感染的主要特征之一。NS3/4A在阻断RIG-Ⅰ信号的同时，还能够切除NF-κB能使病毒激活。IRF-3和NF-κB的双重调节表明NS3/4A可调节细胞内的多种反应。研究表明，NS3/4A能够在体外定向调控TLR3信号通路，NS3/4A蛋白酶能够裂解c372和S373氨基酸之间的TRIF衔接蛋白，并且该裂解位点与HCV NS5A/ B多聚蛋白的裂解位点是同源的。对于NS3/4A结构和功能的研究表明，NS3/4A也可通过结合与切割位点相邻的富含脯氨酸的区域识别TRIF。即便TRIF是TLR3信号通路中所必需，但是TRIF并不在RIG-Ⅰ途径中发挥作用，因此NS3/4A裂解TRIF的过程并不为RIG-Ⅰ途径调控。NS3/4A裂解TRIF的过程阻止了TLR3信号通路的产生，从而阻断IRF-3和NF-κB的活化，进而阻止了干扰素的产生。NS3/4蛋白阻遏被感染细胞中的RIG-Ⅰ通路和TLR3通路，是HCV侵染细胞后逃避干扰素的两个主要途径。这一观察已经通过药理方面的研究得到了进一步的验证，用NS3蛋白酶抑制剂评估NS3/4A蛋白在介导IFN信号通路过程中所发挥的抑制功能，结果表明蛋白酶抑制剂能够有效地解除HCV对RIG-Ⅰ信号途径和TLR3信号途径的干扰作用，从而恢复病毒激活并诱导IRF-3的磷酸化作用，并同时激活NF-κB。细胞的蛋白酶抑制剂疗法也能保护TRIP被NS3/4A裂解[2]。

HCV感染干扰RIG-Ⅰ信号通路会产生以下几种影响。首先，病毒控制RIG-Ⅰ信号通路能够使受感染的细胞和组织减少干扰素的产生。其次，这些途径的许多组分都能导致干扰素应答反应，尽管表达水平比较低，但在细胞和组织暴露在IFN-α后，它们的表达量可以增加。这些因子介导干扰素的作用加强了宿主应答的强度和长度[21]。IPS-1的裂解阻断了NS3/4A发出的信号从而破坏了干扰素的产生，以至于在干扰素疗法中限制了诱导ISG的很多方面，其中包括了ISG的多样性和表达水平。第三，HCV感染对RIG-Ⅰ信号通路和天然免疫应答具有抑制作用，这种作用可能是由于受感染的肝组织抗原发生了改变。导致了激活T细胞的效率降低，并通过破坏先天免疫与适应性免疫之间的相互作用，使适应性免疫应答无法正常清除被HCV感染的肝细胞。肝内ISG的表达水平和T细胞对不同位置的病毒应答之间存在某些关联，这两者都与病毒的清除率和慢性感染呈负相关[22]。第四，IRF-3有抑制肿瘤细胞生长，促使肿瘤细胞凋亡的功能，长期阻止IRF-3的活化作用可能会扰乱这些功能，在感染细胞内引起致瘤表型，这为感染慢性HCV和感染肝细胞癌提供了必要的物质基础。最后，NF-κB功能的阻断可能会干扰依赖NF-κB的多种趋化因子基因和细胞因子基因的表达，从而导致对病毒感染的炎症反应[23]。

4 HCV对干扰素下游信号的影响

患者感染Ⅰ型HCV的临床数据表明，干扰素反应对HCV治疗的总体效率比较低，HCV可以有效地逃避干扰素在体内的抗病毒作用。许多研究都集中在HCV逃避和抵抗干扰素作用的分子机制方面[24]。这些研究表明，HCV蛋白的表达与STAT1功能的抑制有关，并且可以使STAT产生酪氨酸磷酸化。对转基因小鼠肝细胞中表达的HCV蛋白的分析结果表明，只有低于STAT酪氨酸磷酸化水平时才能对STAT1进行调控，并会导致肝脏不产生干扰素应答。STAT的功能障碍可能是由于蛋白磷酸酶2A使STAT1低甲基化导致，其与激活STAT1(PIAS)的蛋白抑制剂形成复合物。研究发现该修饰能阻止STAT1组装到ISGF3复合物中，抑制ISG的表达。研究表明，HCV核心蛋白的表达与细胞信号传导抑制因子SOCS-3的水平升高有关[25]。细胞因子信号传导抑制蛋白(suppressor of cytokine signaling，SOCS )家族的SOCS-3属于负调节因子，并且也是JAK-STAT信号的抑制剂，因此SOCS蛋白能够抑制IFN的产生,从而介导一个经典的负反馈回路。一方面SOCS-1和SOCS-3能够使ISG表达水平降低，另一方面由HCV的核心蛋白诱导产生的SOCS-3也可能会逃避干扰素的作用。然而，尚不清楚SOCS-3在HCV感染过程中的总体作用机制。此外，有研究表明，与活化的STAT2分子相关的一种被称为泛素样修饰E3连接酶(ubiquitin-like modifier E3 ligase)在抑制HCV复制的过程中发挥着重要的作用[26]。

5 病毒对宿主细胞的逃避机制

HCV感染的过程为病毒适应新的宿主环境带来了压力，HCV在适应新的宿主时会逃避宿主的控制以及微调宿主对感染的反应。最显著的特点是，HCV能够干扰细胞免疫中CD4+与CD8+T细胞的正常分化，扰乱T细胞对病原体的记忆功能，以及行使细胞毒性T细胞的免疫作用[27]。虽然在受感染的细胞内存在RIG-Ⅰ、TLR3和其他宿主防御信号通路来调控病毒的感染，但由于病毒传播而导致的急性感染仍会存在。在病毒与宿主细胞表面高度吻合的HCV突变体能够介导信号干扰，包括NS3 / 4A蛋白酶阻断RIG-Ⅰ信号通路和TLR3信号通路。在急性感染期间，病毒变异株的激活能够控制宿主产生的干扰素及ISG表达的差异，从而介导局部肝组织的抗病毒反应。15%～25%的感染者接触HCV通常会导致急性感染或感染消退，这表明宿主的肝脏内的强烈应答反应可以防止HCV的复制和传播。随着人源化小鼠和树鼩作为HCV感染模型在免疫系统抗病毒研究中的普及及应用，这对于深入理解HCV感染宿主后所发生的一系列生物学过程起到了不可忽视的作用[28-29]。宿主的抗病毒反应和随后的先天性免疫反应，能够诱导宿主对病毒的免疫防御，以及调控病毒的免疫逃避从而限制病毒的生长。不论是研究HCV感染细胞后所产生的一些列抗病毒，还是拮抗免疫反应机制所取得的研究成果，这些都为研究人员设计免疫治疗HCV临床病例提供了有价值的参考依据。

6 小结与展望

通过总结HCV在人体内持续感染的能力与病毒克服宿主免疫系统的逃避机制有关，HCV还可抵御干扰素治疗的抗病毒反应，以及HCV病毒对宿主细胞的逃避机制的归纳。无论是研究HCV感染细胞后所产生的一些列抗病毒，还是拮抗免疫反应机制所取得的研究成果，亦或是HCV对于干扰素上、下游的调控作用，这些都有助于研究人员设计免疫治疗HCV临床病例提供了有价值的参考依据。