水貂阿留申病毒检测方法研究进展

刘 艺，冷 雪，时 坤，李健明，曾范利，宗 颖，宫庆龙，张姗姗，孙志博，刘亚东，杜 锐

（吉林农业大学，吉林长春130118）

水貂阿留申病(Aleutian disease of mink,ADM)是一种能够令宿主终生携带并引起机体免疫系统紊乱的毒血症。水貂阿留申病毒(Aleutian disease virus，ADV)感染幼貂，可在其肺泡Ⅱ型细胞高效复制，引起急性致死性间质性肺炎，而感染成年貂，则主要感染淋巴结巨噬细胞，呈低水平病毒复制，引起以脾肿大、高丙种球蛋白血症、浆细胞增多、动脉炎、免疫复合物型肾小球肾炎为特征的慢性疾病，可致使水貂消瘦，繁殖力低下[1-2]。病畜的临床表现分急性和慢性。急性患病个体通常无明显症状突然病死，死前出现痉挛。慢性病例一般有2个～3个月的潜伏期，发病后的病程可持续数月甚至1年，病死率极高。患病动物一般表现为极度口渴、暴饮，并产生一定程度的神经症状，主要表现为抽搐痉挛、共济失调、后驱麻痹等。患病动物食欲减退甚至拒食，被毛无光、稀疏、粗糙、绒毛骤减。我国所有的水貂养殖场几乎均被感染，严重者感染率高达94.59%[3]。截止到目前为止，仍没有成品疫苗能够用于有效的预防和治疗该病，因此，亟需可大批量检测、操作简单、快速且特异性强的检测方法来帮助净化该病。

1 碘凝集试验

碘凝集试验(iodine agglutination test,IAT)的原理是携带ADV的水貂，其血清在鲁戈氏碘液的凝集试验下白蛋白和球蛋白比例发生变化,生成大块的褐色絮状凝集物。此方法的特点操作简单、快速，比较经济，适于群检。但由于如结核病、肝病、肾病、肺病等可引起血清γ球蛋白增高的疾病，都能出现ITA的阳性反应，且在ADV感染1周以内的检测可能出现IAT阴性反应，所以使用该方法的检测结果中容易出现假阴性、假阳性，因而，这种做法只能作为检测该病的一种辅助方法。

戚永娜等[4]对30 个45 日龄水貂血清样本分别进行了IAT与对流免疫电泳(counter immunoelectrophoresis CIEP)检测，结果显示两者的符合率为63.33%。任二军等[5]检测的成年水貂ITA与CIEP对的符合率达到了81.55%。二者检测结果差距悬殊的原因可能是由检测水貂的日龄差距所引起。前者所检测的45日龄水貂体内γ球蛋白含量较低，用ITA得不到有效的检测。

2 酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)技术的应用已在国内国外日渐成熟，因其自动化的检测方式，节省了大量人力，非常适合批量检测。Ma F等[6]通过合成了VP2蛋白的六种肽，将其用作ELISA抗原以检测ADV抗体，筛选出反应原性好的肽开发了ELISA方法，其敏感性为98.0%、特异性为97.5%。此外，通过ELISA检测到的342例早期感染样本在CIEP检测中显示为阴性，在PCR检测中显示为阳性，其中43.6%(149/342)为真阳性。这些结果表明，与CIEP相比，肽ELISA具有更好的灵敏度，因此在检测抗AMDV抗体的血清学筛选中选用肽ELISA效果更好。Chen X等[7]利用重组VP2332-452蛋白作为抗原建立ELISA检测法，同时利用CIEP作为参考试验与Western bolt检测结果相比较。结果显示，VP2332-452ELISA方法的特异性和灵敏度分别为97.9%和97.3%，高于Western bolt检测方法。因此，该VP2332-452ELISA可作为针对ADV抗体检测的优选方法。

3 对流免疫电泳

CIEP是国际上公认的ADV检测金标准，广泛应用于各国水貂养殖厂ADV检测。该方法操作简单，可检测到感染初期水貂的ADV抗体，在这方面优于IAT。与此同时，该方法特异性高达97%，敏感性超过75%，证明了该方法出现假阳性的概率较低[8]。由于该方法抗原制备复杂且昂贵，国内外学者始终致力于对其抗原的制备与优化。关于抗原的制备方法，目前主要是从脏器与细胞中提取，采用真核表达系统和原核表达系统表达的蛋白也可作为抗原[9]。

4 聚合酶链反应

聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)方法针对病毒检测的特异性，准确性均远超CIEP方法，但因其检测成本较高等因素的限制，用于ADV感染情况检测的样本小，检测的结果不能够准确地反映一个地区养殖水貂 ADV感染的实际情况。

许秋等[10]根据基因库中ADV 的NS1 基因核苷酸序列，设计合成了一对特异性引物，优化各反应条件，建立了ADV的PCR检测方法，与对CIEP相对比，PCR法检测ADV的阳性检出率提高了7%，达到了90%。表明PCR技术检测的特异性和灵敏性相比CIEP 均有所提高，可更加快速、准确地检测ADV。2013年，张蕾等[11]利用 PCR方法首次发现了国内貉感染ADV。邵西群等[12]曾报道 PCR 检测方法灵敏性高，可直接应用于检测ADV。利用 PCR检测方法发现来自不同时期的血样、不同组织样品的检测结果存在差异，这表明了动物感染过程中病毒的不稳定性。

5 纳米PCR方法

纳米PCR方法(nanoparticle-assisted polymerase chain reaction,NanoPCR)作为一种新进发现且尚未开发完整的PCR技术，其技术原理尚不明确，目前广泛推测其利用胶体金所具备的良好的导热性与吸附DNA的能力，使反应快速达到目标温度，增强了反应灵敏度并且减少了反应的非特异性。

杨瑞梅等[13]利用ADV NS1基因保守序列设计了一对特异性引物，并优化纳米 PCR反应条件及胶体金浓度，建立了ADV纳米 PCR检测方法，该方法中胶体金制备简单，用量少，不仅使检测成本降低，也使PCR反应体系扩增效率提高了10倍，有利于ADV的大量检测。对比质粒模板与粪尿样品提取到的DNA模板的纳米PCR检测结果，前者是后者的10倍。考虑到在血清学检测中因采血对水貂造成的应激反应带来的危害，而若能从粪便、尿样中检测该病毒，将会给该病的诊断提供极大便利，为ADV检测提供新的方法。

6 实时荧光定量PCR方法

实时荧光定量PCR( real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)方法有其独特的优点，包括特异、快速、敏感性高、荧光动态检测、结果自动分析等，当前已被广泛应用于各类病毒性疫病的诊断研究。新型的TaqMan-MGB探针技术，其特点是探针本身不发荧光，3′端连接有MGB基团，该基团的存在能增加探针的解链温度，因此实时荧光定量PCR方法可以设计比较短的探针，提高了探针特异性，解决了普通TaqMan探针需要设计较长探针的局限性[14]。不仅荧光本底更低、分辨率与敏感度更高、稳定性及特异性更强，结果更为精确，而且可将探针的Tm值提高10℃左右[15-16]。MGB技术的优势可在双重或多重荧光定量PCR方法中得到更好的体现。

贾赟等[17]利用TaqMan-MGB探针中MGB基团所具有的增加解链温度、减短探针长度的特点，建立了水貂阿留申病病毒MGB荧光定量PCR检测方法。该法探针较短，很大程度上增加了检测的特异性，解决了普通的TaqMan因探针设计较长所造成的特异性不强的弊端[18]。

7 免疫复合物检测法

免疫复合物检测法(circulating immune complex,CIC)由于水貂感染ADV后体内产生的中和抗体量很少，甚至不产生中和抗体，而产生的大多数抗体，不仅不能中和病毒，还能介导抗体依赖性增强作用，从而促进ADV进一步侵染靶细胞，并与机体产生的抗体形成复合物，因此，针对抗原抗体复合物的检测也成为了诊断该病的一种方法。赵元楷等[19]所建立的聚乙二醇沉淀比浊法就是通过检测抗原抗体复合物，进而检测ADV，该方法已在临床实践中应用。

8 胶体金试纸条

胶体金试纸条(colloidal gold test strip,GICA)是一种将免疫胶体金技术与层析法(以膜为固相载体的快速检测技术)相结合的检测技术，在动物疫病诊断领域发展迅速。利用胶体金免疫层析技术检测ADV不仅具有较强的特异性，而且检测迅速、不需要特殊的仪器设备，并具有操作流程简洁、检测结果明显、易于判断、特异性强、敏感性髙等优点，适用于大规模检测以及试验条件较低场所的临床样品检测。目前，对于检测ADV抗原抗体的GICA研究并不多。徐磊[20]初步建立了GICA法，其利用重组VP2蛋白作为标记抗原来诊断ADM,该诊断方法相较于普通诊断方式更加快速，且定性准确、反应灵敏。

9 环介导等温扩增技术

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification ，LAMP)是一种恒温扩增技术，使用该检测技术对 ADM进行临床诊断和流行病学调查时具有简单、快速、敏感和准确的特点，既能满足ADV的实验室检测，又适合于基层的快速筛查[21]。贾赟等[22]建立了ADV LAMP检测方法，并用LAMP、定量PCR、普通PCR方法对实验室保存的水貂病料进行ADV检测，LAMP与定量PCR检测结果的符合率为100%，与普通PCR相比，阳性病料检测检测符合率为91.8%，阴性病料检测结果符合率为92.9%，说明可以用于临床样品的大批量检测。

10 防控

Liu D等[23]利用分离得到的ADV大连125株构建了全基因核酸疫苗。使用pcDNA3.1-ADV-428-487核酸疫苗免疫水貂，获得ADV抗体。ADV攻毒后对比发现，使用pcDNA3.1-ADV-428-487核酸疫苗免疫的水貂血清中γ-球蛋白含量较低，尽管pcDNA3.1-ADV-428-487核酸疫苗尚未表现出对ADV的完全保护，但它在防控由ADV引起的水貂种群损失方面，具有作为疫苗潜在的优势。

11 小结

由于我国养殖规模和养殖密度大，养殖方式较为原始，养殖区没有统一规划，养殖户缺乏对养殖场疫病的防控意识。且甚少的进行环境检测以确认病毒的传播途径[24]。这些都增加了ADM在我国的防控和根除的难度。CIEP是目前为止国际上公认的检测ADV抗体的一般方法[25]。ELISA适合可实现高通量检测，已经被加拿大和美国承认该检测方法在临床实践中可提供参考，目前大多数国家开发的控制该病是基于CIEP或ELISA的血清学测试[26-27]。胶体金试纸条能够实现ADV快速检测，PCR法可以弥补CIEP的漏诊，因此在检测时需要根据实际情况，如样本量、检测人员的操作能力等选择合适的检测方法，从而达到逐步淘汰阳性水貂，净化种群的目的。