超级细菌及新药研发方向

侯 晓，吴 润，蒲万霞

(1.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所/中国农业科学院新兽药工程重点开放实验室/甘肃省新兽药工程重点实验室，甘肃兰州 730050；2.甘肃农业大学动物医学学院，甘肃兰州 730070)

随着各种抗菌药物层次不穷的出现，使临床上的大多数感染性疾病得到控制。但同时也使人类和畜禽对抗菌药物产生了依赖，从而增加了抗菌药物的使用。从2004年人类使用抗菌药药物的总消费已经增长了20%。在丹麦，2013的抗菌药物总消费比2012年的高出1.2%，特别是四环素和青霉素[1]。我国目前抗菌药物使用最多的还是头孢霉素类和青霉素类，多集中在华东地区。在巨大的选择压力下，细菌产生出广泛的机制来抵抗抗菌剂的作用，致使各种耐药菌不断出现。同时耐药菌从细菌发展到真菌，病毒，寄生虫，如耳念珠菌最初出现在日本，目前在美国疾病控制中心发布了将所有真菌的病例报告给该机构的临床警报[2]。耐药菌的出现不仅危害人类的健康，还是重要的生态环境污染问题。加快研究新型抗耐药菌药物是解决问题的关键。

1 超级细菌的发现

超级细菌并不是指一种细菌，而是对多重耐药细菌的总称，是对抗现有绝大多数抗生素的细菌。超级细菌的出现并不是突然的，而是在漫长的历史中累积和演变来的，抗生素的长期使用和滥用则加快了这一进程。常见的超级细菌主要有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin resistantStaphylococcusaureus，MRSA)、耐多药肺炎链球菌(multi drug resistantStreptococcuspneumoniae，MDRSP)、耐万古霉素肠球菌(vancomycin resistant Enterococcus，VRE)、产超广谱β 内酰胺酶细菌(extended-spectrumβ lactamases，ESBLs)、碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniaecarbapenemase，KPC)、多重耐药鲍曼不动杆菌(multi-drug-resistantAcinetobacterbaumannii，MDRAB)、多重耐药性结核杆菌(multi-drug resistant tuberculosis，MDR-TB)和多重耐药铜绿假单胞菌(multiple-drug resistantPseudomonasaeruginosa，MDR-PA)及携带有NDM-1的新型超级细菌等。目前，危害最严重的就是携带有NDM-1的新型超级细菌,因为它的活性部位是金属离子，首先在印度新德里被发现，因此将这种超级细菌称为“新德里-金属-β内酰胺酶-1”(New Delhi metallo-β-lactamase-1，NDM-1)，它能水解几乎所有含β内酰胺环结构的抗生素，主要存在于大多数细菌的DNA和质粒中，从而使细菌产生广泛的耐药性[3]。

2 超级细菌的耐药性

细菌的耐药性正是细菌对药物产生了抗性基因，使细菌对药物的敏感性降低甚至消失。超级细菌耐药性的形成其实是细菌适应生存和不断发展的过程，某些细菌对一些抗生素天生就不敏感，即天然耐药性；还有一部分耐药性是细菌在环境、药物等选择压力下，通过基因突变或转移而产生的，即获得耐药性。例如，NDM-1超级细菌就是通过外源转移获得新的DNA片段，能够在细菌间水平转移传播。超级细菌的耐药性可在不同菌属之间水平传播，通过质粒、转座子和噬菌体等，并且可携带一种或多种抗性基因。如刘建华等[4-6]发现了对多黏菌素具有耐药性的MCR-1基因；MCR-1基因存在于质粒，在不同菌种间扩增和转移速度极快，阳性样本比例逐年增加。耐药菌通过耐药基因的转移、扩散、传播、传代、变异形成高度和多重耐药菌。

近年来，随着抗菌药物的大量使用，产生了多重耐药菌、泛药菌，甚至是全耐药菌，同时出现了对消毒剂的耐药性。目前，受认可的关于NDM-1超级细菌的耐药机制主要为：首先NDM-1第34-37位氨基酸残基形成了一段能够识别、结合和催化水解底物的独特环区，这也是NDM-1具有广谱抗生素抗性的原因，其次活性中心较大、开放、与底物结合、释放时能够产生重排现象。研究发现，NDM-1和MCR-1可以同时存在于同一个细菌中的不同质粒上，且可以一起转移。

3 超级细菌的新药研发

3.1 抗生素的研发

一直以来，人们对抗生素的研究都是利用现代生物学技术对传统抗生素生产菌进行改造和筛选，近年来随着基因组学、代谢组学及高通量测序的快速发展，人们将注意力集中于从天然微生物中寻找新型菌株，研发新型抗生素。有科学家从土壤中筛选出一种新型抗生素teixobactin，通过与肽聚糖前体Lipid Ⅱ和磷壁酸的前体Lipid Ⅲ结合，抑制细胞壁的合成，并且细菌很难对该抗生素产生耐药性[6]。这说明新型抗生素的研究具有较好的前景。

近年新批准的用于治疗难辨梭状芽胞杆菌感染的口服抗生素非达霉素(fidaxomicin dificid)[7]，这种感染能导致腹泻，并可能导致结肠炎和其他肠道疾病。Durata公司已经公布了抗生素达巴万星(dalbavancin)的Ⅲ期临床试验数据，用于治疗皮肤组织感染[8]。

目前对于抗生素的研发有两个方向：一是利用现代生物技术对抗生素生产菌进行改造，提高菌的活性，改进抗生素生产工艺，增加抗生素产量；二是新型抗生素产生菌的筛选，筛选研究方法主要有：①稀有放线菌筛选；②极端环境微生物筛选；③使用特殊培养基和培养条件；④海洋微生物。对已知的抗生素应结合纳米对抗超级细菌，纳米粒子可以通过抑制减少吸收，增加外排，降解产金属β内酰胺酶，改变膜孔蛋白和生物膜形成的作用机制，作为细菌耐药性的潜在调节剂[9]。药物再利用的提出对已知的抗生素药物可以进行再利用或协同结合，而且药物再利用筛选可以很快用于临床试验或治疗，避免了漫长的前期临床研究和Ⅰ期临床试验[10]。如近年用于治疗肺结核的药物delamanid,表现出对内脏利什曼病的抵抗性[11]；抗蠕虫药氯硝柳胺具有抗寨卡病毒的活性，抑制寨卡病毒Zika virus(ZIKV)的复制[12]。利用超高通量筛选技术从已批准的药物中选出了25种化合物对多重耐药肺炎克雷伯菌具有抗菌活性，但由于在人体血浆中浓度有限，不能在临床上作为单一药物使用，所以采取了协同药物组合方式[13]。药物再利用的缺点是从已批准的药物中发现的新活性物质大多不能单一在临床上应用。此外，人们经常只重视了最小抑菌浓度，忽略了防突变浓度(MPC)，所以应该增加 MPC 的指标,重视挑选突变选择窗(MPC和MIC差值)小的新药进行重点研究[14]。

3.2 疫苗的研发

面对超级细菌日益严重的流行趋势，超级细菌疫苗的研发可能是解决这一难题的一个方向。WHO、欧美国家政府及辉瑞、诺华、葛兰素史克等医药公司已经重视了超级细菌疫苗的研发[15]。我国首个超级细菌疫苗——重组金黄色葡萄球菌疫苗，获得了国家食品药品监督管理总局批准Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期的临床研究，标志着该研究已取得阶段性重要成果[16]。囊性纤维化的铜绿假单胞菌感染的疫苗已经开发出来，虽然在于不同的临床阶段[17]，但已没有推荐使用。

目前所研究的超级细菌疫苗主要有鲍曼不动杆菌灭活全菌体疫苗、外膜囊泡、重组蛋白亚单位疫苗、荚膜多糖候选疫苗和联合疫苗，今后的重要方向是研制包含多个优势抗原表位的多亚单位疫苗[18]。铜绿假单胞菌的外膜蛋白I(OmpI)疫苗、重组抗原疫苗、DNA疫苗、重组沙门菌疫苗和外膜蛋白F(OmpF)蛋白疫苗、合成肽疫苗、多表位核酸疫苗等[19-20。联合疫苗将是超级细菌疫苗今后的一个研究方向，如水貂铜绿假单胞菌肺炎克雷伯菌二联亚单位疫苗，奇异变形杆菌-金黄葡萄球菌-铜绿假单胞菌吸附联合疫苗。随着对超级细菌致病机制的不断深入探索和研究，以及逆向免疫学和蛋白质组学的发展，超级细菌疫苗的研发将会被大力推动和发展。

3.3 中草药的研发

中药的抗耐药机制包括：①中药改变细胞膜的通透性，研究发现黄芩的主要成分黄芩苷能够抑制和破坏细菌的生物膜系统，与头孢他啶合用时能够增强对生物膜内铜绿假单胞菌的抗菌活性。②抑制β内酰胺酶的活性，刘坤友[21]研究表明双黄连粉针剂、清开灵注射液抑制大肠埃希菌是通过降低广谱-β内酰胺酶实现的。通过抑制超广谱β内酰胺酶的活性而达到抗细菌耐药性的作用的还有丹参素、重楼皂苷、大黄蒽醌、黄芩、黄酮等8种中药成分[22]。③抑制外排汞，药物外排汞是细菌耐药机制之一，吲哚生物碱是目前研究最为广泛的一类外排汞抑制剂，其中利血平是第一个被证实外排汞抑制剂[23]。④消除耐药质粒，宁官保等[24]研究发现，黄芩、大黄、金银花、黄连、连翘等5种中草药单剂和三黄汤、双黄连2种方剂对鸡源性大肠埃希菌耐药性均表现出不同的消除结果。

此外，中草药作为饲料添加剂使用与抗生素相比，具有毒性低、易被环境中的微生物分解、不易残留和造成污染、不易产生耐药性，对动物机体具有保健和增强免疫保护机能。研究表明，益生菌的代谢活动中可对中草药的部分活性成分进行加工，促进益生菌的增殖；而某些中草药的前体成分经过益生菌的处理后在机体内发挥药效，因此中草药制剂和微生态制剂合用，更能提高治疗效果。韩亚超等[25]将3 种益生菌制剂与黄芪和麦芽联用于断奶仔猪的养殖，发现在仔猪日增重、料肉比和血液生化指标方面，中草药复合微生态制剂的效果更好，防治腹泻的效果也最佳。大多数中草药制剂都具有非常强的抗细菌、真菌和支原体的作用，在猪疫病防控中可以替代抗生素的作用，此外，对于目前兽药市场上的中草药制剂产品，应该规定中草药使用的标准，完善制作工艺质量监控，提高各环节的生产质量[26]。

3.4 从动物体内提取抗菌药物

在自然界中有一些动物通过自身合成和释放的有毒物质，杀灭细菌、病毒和其他的微生物，以保护自己。其中在两栖类动物体内含有生物胺、生物碱、蛋白质和多肽等抗菌物质，尤其是抗多重耐药菌的抗菌肽，如臭蛙体内提取odorranain-HP和从石斑蛙皮肤中提取的grahamin均对金黄色葡萄菌有抑制和杀灭作用。因此，两栖类动物抗菌肽的开发具有非常大的潜力，可用于替代抗生素。此外，还可用超声提取和低温浸提法从草鱼肠道中提取抗菌活性物质，有利于提高草鱼肠道的利用价值[27]。

有研究报道，卫生害虫也具有防御微生物、真菌、细菌的的作用机制，这为寻找抗菌活性化合物提供了可能。即可以从昆虫体内寻找一种对人体健康有利的天然抗菌素，昆虫抗菌素也称为昆虫抗菌肽。如仅在双翅目黑腹果蝇的血淋巴中已发现7 种抗菌肽。蛆虫治疗法能成功的治疗伤口感染和坏死，尤其是治疗由耐甲氧西林金黄色葡萄球菌引起的创面伤口。因此应积极开展昆虫抗菌活性物质新化合物的研究，寻找具有抗菌活性的小分子化合物或昆虫次生代谢物活性组分。如果能够对其深入探索和研究，这将是抗耐药菌药物研究的又一个方向。

3.5 微生态制剂的应用

由于抗生素的大量使用导致细菌耐药性由单一耐药变为多重耐药，所以很多抗生素被限制使用。而微生态制剂的研发与使用将可能代替抗生素作为饲料添加剂，促进生长、预防和临床治疗等。微生态制剂的作用机制主要有：①提高肠道屏障功能，增强机体免疫力；②维持肠道菌群平衡，促进消化吸收能力；③提高饲料转化率，改善养殖环境；④改善体内外生态环境，减少有害物质产生[28]。此外，还有不容易产生耐药性、价格低、无残留、无污染等特点。

微生态制剂分为动物微生态制剂、植物微生态制剂、环境微生态制剂和人体微生态制剂[29]。微生态制剂目前在人体中的临床应用进展包括与抗生素相关性腹泻、肠易激综合征、炎症性肠病、幽门螺杆菌感染、乙型肝炎肝硬化等的治疗相关。在动物饲料应用的国外微生态制剂产品有美国亚联的 Bio-One、英国PIC 公司的Protexin、韩国的Duolac、日本的 EM 复合微生态制剂等。国内市场主要有产酶益生素、芯源康、乳菌宝等。此外，我国研制的培菲康正在临床试验期，“培菲康”CTA获加拿大临床准入，是中国微生态制剂作为治疗性药物海外获批临床应用的首例。由于动物微生态制剂产品在市场上很多，应选用多年来在市场应用中具有正规认同和良好口碑的产品。同时微生态制剂能够抑制有害微生物的繁殖和净化养殖废水，是当今渔业生物防治发展的一个方向[30]。微生态制剂的发展正从单一菌种制剂转向复合菌种制剂，以合适的比例混合培养具有共生或互生关系的微生物，培养时注意提高活菌数，加强稳定性，改进加工工艺。同时还要挖掘新菌种，扩大微生物制剂的来源。

3.6 利用微生物群体感应系统

群体感应(quorum sensing)系统是在微生物界广泛存在的细胞与细胞间的通讯系统。近年来的研究发现极少部分的细菌产生的信号小分子就能够导致整个菌群耐药[31]。细菌群体可通过细胞间协调基因的表达和互相通信联系，对周围不断变化的环境条件做出反应，是细胞之间进行信息交流和调控的机制，当细菌细胞所分泌的信号分子在细菌之间达到一定浓度和阈值时，就能调控细菌的生活习性和生理功能，影响细菌与环境之间的交流与联系。

群体感应系统在细菌耐药机制的形成中发挥了一定的作用，主要是通过调控生物被膜的形成和直接参与药物外排泵的调控。研究表明，QS系统还有增强PA的致病性和耐药性的作用，这一作用通过调控PA毒力因子的产生和生物被膜的形成以及耐药基因的表达来实现[32]。细菌抗生素耐药形成的重要原因之一是过量表达RND家族外排汞，QS系统影响外排汞的基因表达，而外排汞影响群体感应的传输，这一现象为RND家族外排汞的调控机理研究提供了新的方向。研究表明sRNA 和 QS 系统可以相互作用，sRNA 是 QS 系统调控子的重要组成部分，通过调控 QS 系统调控基因表达和对信息整合精确形成广泛的调控网络。近年来发现群体淬灭病害防治策略为解决微生物耐药性问题提供了新的思路[33]。群体淬灭的方式主要有：①降解或修饰信号分子；②干扰信号分子与受体蛋白的识别结合；③阻断群体感应信号的合成通路[34]。群体猝灭剂能够降低微生物的感染，通过抑制微生物群体感应，同时不会影响微生物的生长，也不会对细菌产生选择压力，降低了耐药性的产生，因此可能作为一种高效长久的药物使用[35]。 应用QS系统可以抑制疾病的传播。

4 结语

超级细菌的出现给人类带来了新的挑战，使人们感受到了极大的威胁，其实超级细菌本身并不可怕，真正有威胁的是不断产生新的超级细菌，它们会对更多新的抗生素产生耐药性。抵抗超级细菌刻不容缓，需要加快步伐。目前，美国一家公司将有可能取得第一个裂解酶药物批件，目前正在进行采用裂解酶治疗MRSA败血症的临床一期试验[36]。在2016年9月5号的二十国集团领导人(G20)杭州峰会上，已经将抗生素耐药问题与气候变化和恐怖主义问题等同并列，引起了高度重视。据华尔街日报报道，美国联邦政府财政激励措施使得至少有7种“超级细菌”新药进入后期研发阶段，这些新药将可能用于对付危险的“超级细菌”。相信随着医学和科技的发展，新药的研发一定能够取得进一步的成功。