流式细胞技术检测酸性饮料中菌落总数的研究

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(1.达能(中国)食品饮料有限公司,广东中山 528415; 2.广东出入境检验检疫技术中心,广东省动植物与食品进出口技术措施研究重点实验室，广东广州 510000)

随着科技的发展和人们生活水平的不断提高,食品安全日益受到人们的关注,其中微生物污染是影响食品安全的主要因素,因此作为食品生产企业,对微生物污染的预防和监控显得尤为重要。传统微生物检测方法具有耗时长、工作量大、不易检出芽孢等缺点[1],严重影响了对微生物污染控制的时效性,从而制约了企业的放货速度和运转效率,这是所有食品行业所面临的共同难题。近年来,随着现代科学技术的不断发展,各种快速检测方法如生物荧光法、免疫化学法和流式细胞技术等已广泛运用于食品、饮料、发酵和环保领域,其中流式细胞技术(Flow Cytometry,FCM)因其可解决传统微生物检测手段检测周期过长、无法大批量检测样本等缺点[1]而广受青睐。FCM法是一种采用流式细胞仪检测溶液中悬浮细胞或微粒的现代分析技术,通过荧光探针的协助,从分子水平上获取多种信号,对细胞进行定量分析或纯化分选,有研究报道[2-4]比较了流式细胞法与平板法或滤膜法检测菌落总数,结果发现流式细胞仪检测时间只需2 h左右,而平板计数法或滤膜法则需要2 d左右,而且在一定浓度范围内,前者具有更好的符合性,更加灵敏、准确、高通量,对液态食品的货架期、仓储、保质期、出口等顺利进行提供了高效的技术平台[1,5]。

FCM法在细菌[6-7]、真菌等微生物检测方面的应用已非常广泛[8-9],目前已成为饮料、发酵和环保等微生物质量检测领域的常用工具和有力手段[10-12],但是关于FCM法直接检测低含菌量的酸性饮料菌落总数方面的应用研究,国内还鲜有报道。2015年国家食品安全法提倡食品饮料企业运用先进的技术手段来加速产品放行,因此将流式细胞技术应用到含菌量低的酸性饮料菌落总数的检测,对于饮料行业具有非常重要的现实意义,可以缩短培养时间,加快产品放行,从而提高产品的新鲜度,降低库存成本。

1　材料与方法

1.1　材料与仪器

酸性饮料(pH<4.6)中山市小榄镇超市购买;胰蛋白胨大豆琼脂TSA、平板计数琼脂PCA、营养肉汤TSB、无菌平皿(50 mm & 90 mm)广东环凯微生物科技有限公司;0.85%无菌生理盐水自制;0.45 μm滤膜密理博(中国)有限公司;CS13、ChemSol S 50X、Diluent R、CSR、Isored、Antifoam、Cleaning 5、Cleaning 3、Standard G、ChemChrome V26、CSV、B24梅里埃诊断产品(上海)有限公司；实验用菌株详见表1所示。

BactiFlow ALS system流式细胞仪梅里埃诊断产品(上海)有限公司;生物安全柜/超净工作台苏州安泰空气技术有限公司;生化培养箱美墨尔特(上海)贸易有限公司;三联过滤装置密理博(中国)有限公司。

表1　实验用菌株编号及名称Table 1　Number and name of the test strains

1.2　实验方法

1.2.1菌种的保藏和活化实验菌株在TSA培养基上,(36±1) ℃培养24 h进行复苏,对复苏后的菌株纯度及生化特性做确认,通过一系列的生化实验、16S rDNA测序及MODI-TOF分子生物学鉴定实验确证实验菌株。将表1所列菌株分别接种于营养肉汤TSB培养基中,(36±1) ℃培养24 h 后,菌悬液备用。

1.2.2滤膜法将含菌饮料手动混匀,在无菌操作环境下,抽滤250 mL含菌饮料,用无菌镊子将滤膜转移至平板计数琼脂(PCA),于(36±1) ℃倒置培养(48±4) h,观察并计数[13]。

1.2.3FCM法增菌:将含菌饮料手动摇匀,在无菌操作环境下,抽滤250 mL含菌饮料,用无菌镊子将滤膜转移至100 mL TSB肉汤,于(36±1) ℃培养箱中正置培养。

检测:用无菌移液器移取上述增菌后的菌液100 μL加入20 mL无菌试管中,依次加入90 μL CS13,于无菌环境静置30～60 min。开机清洗校正完成后将含样品的20 mL试管置于SPU样品架,试剂Cleaning 5、还原剂(CSR+DR+隔离油)、CSV和B24放置在试剂架,V26放置在冷却架。编辑程序,运行检测,其稀释倍数为30[14]。

1.2.4平板法将菌液手动摇匀,在无菌操作环境下,用无菌移液器移取1 mL含菌溶液至无菌平皿中,倾注温度为(46±1) ℃的平板计数琼脂(PCA),摇匀,静置凝固后倒置于(36±1) ℃培养箱中培养(48±4) h,观察并计数[15]。

1.2.5FCM法和平板法检测不同基质中实验菌株菌浓度的对比研究以生理盐水为基质,将表1中的新鲜培养物制备成约103～109CFU/mL浓度的菌悬液,分别运用平板法和FCM法对菌悬液的菌浓度进行检测。

以酸性饮料为基质,将表1中的新鲜培养物制备成约103～109CFU/mL浓度的菌悬液,分别运用平板法和FCM法对菌悬液的菌浓度进行检测。

1.2.6增菌时间对FCM法和平板法检测低含菌量样品菌浓度的影响以酸性饮料为基质,选择常见实验菌株13株(A～M),制备浓度为1～10 CFU/250 mL的菌悬液,菌悬液的初始菌浓度由滤膜法确定。另过滤富集250 mL样品中的微生物,将滤膜置于100 mL TSB肉汤培养基中,(36±1) ℃增菌培养6 h和22 h后,使用FCM法与平板法同时检测增菌后的微生物水平,对FCM法与平板法的检测结果与滤膜法的定性检测结果进行比较分析。

1.2.7增菌时间对FCM法检测强壮类和爱媛类芽孢杆菌菌浓度的影响以酸性饮料为基质,选择生长较为缓慢的强壮类和爱媛类芽孢杆菌(A和B),分别制备成浓度为1～10 CFU/250 mL的菌悬液。每个菌株选择6个样品(A-1～A-6,B-1～B-6),样品的菌浓度由滤膜法确定均在1～10 CFU/250 mL的范围内,分别过滤富集250 mL样品中的微生物,将滤膜置于100 mL TSB肉汤培养基中(36±1) ℃培养0、6、22 h后,采用FCM法检测增菌后的微生物水平,每个样品分别上机检测2次,并与滤膜法的定性检测结果进行对比,分析增菌时间对FCM法检测强壮类和爱媛类芽孢杆菌的影响。

1.2.8滤膜法与增菌22 h后FCM法定性结果的统计学分析以酸性饮料为基质,选择常见实验菌株13株(A～M),分别制备成浓度为1～10 CFU/250 mL,10～100 CFU/250 mL和>100 CFU/250 mL的菌悬液。120个阴性样品(无菌酸性饮料)与936个阳性样品(每个菌株每个浓度梯度选择24个样品),分别过滤富集250 mL样品中的微生物,将滤膜置于100 mL TSB肉汤培养基中(36±1) ℃增菌培养22 h,采用FCM法检测增菌后的微生物水平,每个样品分别上机检测2次,并与滤膜法的定性检测结果对比,进行统计学分析。

1.3　数据处理

运用McNemar的Kappa统计分析1.2.8的检测结果[16]。

2　结果与分析

2.1　蜡样芽孢杆菌在不同基质中FCM法和平板法检测结果的一致性研究

图1　FCM法和平板法检测不同基质中蜡样芽孢杆菌结果的线性关系Fig.1　The linearity of FCM and pour plate methods to test bacillus cereus in different substrates

FCM法与平板法检测不同基质中蜡样芽孢杆菌(G)结果的线性关系如图1所示。以生理盐水为基质,蜡样芽孢杆菌有1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108和1×109CFU/mL七个浓度梯度,平板法和FCM法检测结果的线性关系为R2=0.9823>0.95;以酸性饮料基质,蜡样芽孢杆菌有1×105、1×106、1×107、1×108和1×109CFU/mL五个浓度梯度,平板法和FCM法检测结果的线性关系为R2=0.9607>0.95。说明在酸性饮料和生理盐水中两种方法对于蜡样芽孢杆菌菌浓度的检测在一定浓度范围内均具有较高的相关性,无显著性差异,采用FCM法可以准确的检出蜡样芽孢杆菌。

2.2　不同基质对FCM法与平板法检测13种实验菌株菌浓度的影响

不同浓度13种(A～M)实验菌株在酸性饮料中和生理盐水中FCM法和平板法的检测结果如表2所示。以生理盐水为基质时,FCM法和平板法的计数结果表现出较高的一致性,除菌株E和G外平板法与FCM法检测结果均在一个数量级上。以酸性饮料为基质时,其中C、D、E、F、H、I、L、M均不能被FCM法检出,另A、B、G、J、K可以被平板法和FCM法检出,但差异较大。一方面可能是由于酸性饮料基质成分会特异性的干扰部分菌株;另一方面可能是FCM的检测限一般在102～103CFU/mL,对于低含菌量的样品无法检测出其初始菌浓度[17-18]。故针对含菌量低的酸性饮料可过滤富集后增菌培养,一方面排除基质的干扰[4],另一方面通过增菌培养达到FCM法的最低检测限,以获得与滤膜法或平板法更为一致的定性结果。

表2　FCM法与平板法检测不同基质中13种实验菌株的菌浓度结果对比Table 2　The results comparison of FCM and pour plate methods to detect 13 strains in different substrates

2.3　增菌时间对FCM法和平板法检测低含菌量样品菌浓度的影响

表3　酸性饮料中13种实验菌株经增菌6 h和22 h后FCM法和平板法的检测结果Table 3　The results of FCM and pour plate methods to detect 13 strains in acid beverage after proliferation for 6 h and 22 h

增菌时间对FCM法和平板法检测低含菌量样品菌浓度的影响如表3所示。初始菌液经滤膜法计数均为阳性,增菌6 h后,强壮类和爱媛类芽孢杆菌(A和B)可以被平板法检出而不能被FCM法检出,可能是由于强壮类和爱媛类芽孢杆菌生长分裂缓慢,故在培养6 h后含菌量还不足以达到FCM法的最低检测限;当增菌时间延长至22 h,13种实验菌株经FCM法检测均能获得与滤膜法一致的定性结果,且FCM法的定量检测结果与平板法均在一个数量级,说明增菌22 h,可以获得更为稳定的结果。

2.4　增菌时间对FCM法检测强壮类和爱媛类芽孢杆菌菌浓度的影响

酸性饮料中不同浓度强壮类和爱媛类芽孢杆菌(A和B),经增菌0、6、22 h后,FCM法的检测结果如表4所示。0 h时,FCM法检测结果为阴性,显示未检出;增菌时间延长至6 h,部分FCM法检测结果为阳性,与滤膜法的定性结果是一致的,但仍有部分FCM法检测结果显示阴性,说明部分菌株生长稍缓慢,在增菌6 h的情况下,菌株还未能繁殖至FCM法的最低检测限,从而无法与滤膜法获得一致的定性结果。当增菌时间延长至22 h,所有样品的FCM法检测结果均显示阳性与滤膜法的定性结果一致,说明增菌时间达到22 h时,FCM法可替代滤膜法进行酸性饮料中强壮类和爱媛类芽孢杆菌的定性检测。

2.5　滤膜法与增菌22 h后FCM法定性结果的统计学分析

对酸性饮料中低、中和高浓度的13种(A～M)实验菌株进行滤膜法与FCM法检测结果的定性对比研究。在增菌22 h的条件下,对于低、中和高浓度的13种实验菌株FCM法与滤膜法表现出高度一致的定性结果,统计学分析见表5所示。在初始含菌量<1 CFU/250 mL的情况下,卡方值X2=1.5<3.84，FCM法的假阳性率=4.2%<9.6%，特异性=95.8%>90.4%;当初始含菌量在1～10 CFU/250 mL的范围内时,卡方值X2=1.1<3.84,FCM法的假阴性率=1.9%<2%,灵敏度=98.1%>98%;当初始含菌量>10 CFU/250 mL时,灵敏度=100%>98%,无假阴性的结果。以上统计学分析[16]表明滤膜法与增菌22 h后FCM法的定性结果无显著差异；在增菌22 h的条件下,FCM法可替代滤膜法进行酸性饮料中菌落总数的定性检测,从而缩短检测周期,加速产品放行。

注：a:每250 mL酸性饮料中含有的细菌总数的可能数;b:反应FCM法和达能滤膜法确认性结果相等的数量;c:样品的数量;d:x2由NcNema定义为(|m-n|-1)2/(m+n)，其中m等于FCM法的阳性样本数和达能滤膜法的阴性样本数，n等于FCM法的阴性性样本数和达能滤膜法的阳性样本数。x2值大于3.84表示显著性差异为p<0.05。e:假阴性率为100-灵敏度;f:灵敏度定义为100乘以“已知”阳性测试样品数除以“已知”样品总数，“已知”指用参考方法确认;g:假阳性率为100-特异性;h:特异性定义为100乘以“已知”阴性测试样品数除以“已知”样品总数，“已知”指用参考方法确认。

3　结论

本研究采用FCM法替代滤膜法定性检测低含菌量酸性饮料的菌落总数,通过添加不同类型的13种(A～M)实验菌株进行验证。模拟酸性饮料在不同浓度不同种类微生物污染的情况下,过滤富集菌于TSB肉汤中增菌培养一定时间,经FCM法检测,并与平板法和滤膜法进行对比分析。结果表明:FCM法可替代滤膜法用于酸性饮料菌落总数的定性检测从而加速产品放行。FCM法可短时间内出具产品的微生物分析结果,能够对生产、运输和库存环节的微生物污染进行及时有效的控制而产生巨大的经济效益[19],比滤膜法或平板法节省1 d的检测时间。FCM法检测成本高,因此应进一步加强试剂和耗材的研究和开发,降低检测成本,从而使FCM法检测菌落总数可以得到更为广泛的运用;其次进一步缩短培养时间或运用FCM法对低含菌量酸性饮料中霉菌、酵母以及耐酸菌的检测在食品饮料企业亦具有非常广大的应用前景。

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