超高效液相色谱-串联质谱测定畜禽肉中硝基呋喃代谢物方法关于pH值的优化探讨

焦作市畜产品质量安全监测中心 454150

1 引言

硝基呋喃类抗生素是具有5-硝基呋喃基本结构的广谱抗菌药物，主要包括呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林和呋喃妥因，能够有效防治伤寒、副伤寒和家禽原虫病（如球虫、组织滴虫、卡氏白细胞原虫等），还对大肠杆菌性败血症及呼吸道疾病的继发性细菌感染有一定的防治效果[1]。硝基呋喃类作为兽药主要用于抗菌消炎，广泛应用于家畜家禽的痢疾、肠炎、球虫病的预防和治疗[2]，也在动物饲料中作为添加剂使用[3]。硝基呋喃类药物在动物体内代谢迅速，但其代谢物与动物组织蛋白结合稳定存在，具有致畸、致突变和致癌作用。

研究表明，禽肉中硝基呋喃类代谢物含量比其他动物组织中高，因此准确快速检测硝基呋喃类代谢物可以增加畜禽产品的质量安全。超高效液相色谱-串联质谱法检测硝基呋喃类代谢物具有快速、准确和灵敏度高的特点，其中前处理中pH值的调节较大影响实验的准确度，本文重点探讨pH值的优化条件。

2 材料

（1）仪器与试剂。液相色谱-串联质谱仪（配电喷雾离子源）美国Waters公司Waters ACQUTYTM UPLCXevo TQ-S、天平感量0.01g、涡旋混合器、振荡器、组织匀浆机、离心机、恒温振荡水浴摇床、氮吹仪和pH计。AOZ对照品、内标AOZ-D4对照品、AMOZ对照品、内标AMOZ-D5对照品、AHD对照品、内标AHD-13C3对照品、SEM·HCI对照品、内标 SEM·HCI-[1,2-15N2;13C]对照品、2-硝基苯甲醛、乙酸铵、磷酸三钾、浓盐酸、乙酸乙酯、甲醇色谱纯、甲酸色谱纯、乙腈色谱纯。

3 方法步骤

（1）试样的制备。取适量新鲜或冷冻的空白或供试样品，混匀。

（2）质量控制样品的制备。取空白试样，与待测样品同步处理。取空白试样2g，添加20ng/mL的混合标准中间工作液0.1mL与20ng/mL的混合内标中间工作液0.1mL，制得浓度1.0μg/kg的阳性添加试料，与待测试样同步处理。

（3）洗涤。称取供试试料2±0.02g置具塞离心管中，加10mL50%甲醇溶液，涡旋，中速振荡10分钟，然后8000r/分钟离心5分钟，弃上清液（小心缓慢地将上清液倒掉即可）。向离心管中加入10mL50%甲醇溶液，重复洗涤一次。按上述洗涤过程用乙醚洗涤2次。

（4）衍生。洗涤后试料加20ng/mL的混合内标准中间液0.1mL、用刻度吸管加入0.2mo1/L盐酸5mL和0.1mo1/L2-硝基苯甲醛的溶液100uL，涡旋、混匀。（37±1）℃避光水浴震荡约16小时。

（5）提取。将衍生后的试料在避光条件下自然冷却至室温，用1mo1/L磷酸三钾溶液调节pH值至6、7、7.3、7.6、8、9（衍生加入 0.2mo1/L 盐酸溶液 5mL 的试料需加入1mo1/L磷酸三钾溶液约0.85mL）。加乙酸乙酯5mL，涡旋、中速振荡5分钟，3000r/分钟离心10分钟，吸取上清液；用乙酸乙酯5mL重复提取一次，合井乙酸乙酯层于40℃水浴下氮气吹干。用初始流动相（5%乙腈含0.1%甲酸）水溶液1.0mL溶解残余物（若发现试样浑浊，可将试样转移到1.5mL离心管，2000r/分钟离心10分钟），经过滤后作为试样溶液，供高效液相色谱-串联质谱仪测定。

4 结论

本试验优化了超高效液相串联质谱法测定鸡肉中硝基呋喃类药物代谢物的方法。样品经洗涤后去除杂质，在酸性条件下水解，与加入的2-硝基苯甲醛溶液进行衍生化反应，反应产物调pH7.6后经乙酸乙酯提取，氮气吹干，5%乙腈含0.1%甲酸水溶液溶解残余物，用高效液相色谱-串联质谱仪测定。四种硝基呋喃代谢物内标的使用补偿了前处理过程对最后定量结果的影响，结果准确可靠。