用稀释回归法对微量血浆标本进行凝血功能检测的效果探讨

毛睿哲，邵雪君

（苏州大学附属儿童医院，江苏 苏州 215000）

凝血功能检测是临床上在进行止血与血栓筛查时常用的检查方法，包括进行凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶时间（TT）及纤维蛋白原（FIB）检测等[1]。过去，临床上常用手工法进行凝血功能检测。该方法具有检测过程繁琐、耗时较长、对操作人员的要求较高等弊端，已无法满足现代临床的需求。目前，临床上主要使用全自动血凝仪进行凝血功能检测[2]。该仪器对受检的血浆标本的容量有一定的要求。然而，在儿科临床上，新生儿及部分患儿（如患有先天性心脏病）血细胞的比容（多在0.530%～0.800%之间）通常明显高于正常儿童[3]，其血浆的容量则小于正常儿童。而且，在用全自动血凝仪对微量血浆标本进行检测时，探针的运动精度、零部件的磨损程度等因素均可导致探针无法吸取足量的血浆标本，或仅吸取了血浆下的血细胞，导致探针的针孔被堵塞，进而使仪器发生故障。因此，如何合理地利用微量的血浆标本进行凝血功能检测成为临床上研究的重点。有研究人员发现，在血浆标本中加入与全自动血凝仪配套的样本稀释液等液相物质，加大血浆标本的容量，可满足仪器对血浆标本容量的要求。在本次研究中，笔者通过对苏州大学附属儿童医院收治的43例患儿的血浆标本、2倍稀释度血浆标本和3倍稀释度血浆标本进行PT、APTT检测，探讨用稀释回归法对微量血浆标本进行凝血功能检测的临床效果。

1　标本采集与检测方法

1.1　标本采集

随机选取某日在苏州大学附属儿童医院门诊、心内科、神经内科、新生儿科、血液科及外科等就诊的43例患儿作为研究对象，分别采集其2ml的血浆标本。在采集血浆标本后的1 h内进行本次试验。对于血细胞比容在0.250～0.550之间的患儿，使用以浓度为3.2%的枸橼酸钠溶液（109 mmol/L）为抗凝剂的真空抗凝管，按1：9（抗凝剂与血浆的比例）的比例采集其1.8ml的全血，将二者充分混匀后，以4000 r/min的速度进行10min的离心处理，然后得到2ml的血浆标本。对于血细胞比容＜0.250、＞0.550的患儿，依据Macgann推荐公式计算其抗凝剂的使用量。该公式为：抗凝剂用量（ml）=0.00185×全血量（ml）×[100-患者的血细胞比容（%）][4]。在使用上述的公式计算出抗凝剂的使用量后，将相应量的枸橼酸钠溶液（109 mmol/L）加入到惰性塑料采血管内。用一次性塑料注射器抽取患儿1.8ml的血浆，将其立即注入到惰性塑料采血管内，盖紧瓶盖，使其与抗凝剂充分混匀，然后以4000 r/min的速度进行10min的离心处理，得到血浆标本。

1.2　仪器与试剂

使用法国STAGO STA-R全自动血凝仪及其配套的试剂与定值质控血浆进行本次试验。PT试剂与APTT试剂的批号分别为250498、250596。使用与全自动血凝仪配套的Owern-Koller稀释液进行血浆标本稀释。正常（N值）定值质控血浆和病理（P值）定值质控血浆的批号分别为12351、12352。在此前进行的预试验中笔者发现，对血浆标本进行4倍的稀释后，其APTT值常高于180 s，超出了全自动血凝仪的检测范围。因此，本次试验选择2倍稀释度血浆标本和3倍稀释度血浆标本作为研究的对象。已有的研究报道指出，使用STAGO STA-R全自动血凝仪进行FIB检测能呈现良好的线性相关度[5-6]，故本文也不再对其进行赘述。

1.3　方法

从这43例患儿的血浆标本中分别吸取1ml的血浆，作为原血浆标本。从这43例患儿的血浆标本中分别吸取0.5ml的血浆，将其与0.5ml 的Owern-Koller稀释液充分混匀，将该混合液作为2倍稀释度血浆标本。从这43例患儿的血浆标本中分别吸取0.5ml的血浆，将其与1ml的Owern-Koller稀释液充分混匀，将该混合液作为3倍稀释度血浆标本。使用STAGO STA-R全自动血凝仪对上述的三种血浆标本进行检测，分别得出每种血浆标本的PT值、APTT值。原血浆标本的PT值、APTT值若与2倍稀释度血浆标本、3倍稀释度血浆标本的PT值、APTT值呈线性相关，则可得到相应的线性回归方程。将2倍稀释度血浆标本、3倍稀释度血浆标本的PT值、APTT值分别代入回归方程中，然后将得到的结果与原血浆标本的检测结果进行对比，观察这三种血浆标本的检测结果是否存在统计学差异。

1.4　统计学处理

采用SPSS19.0统计软件对本次研究中原始数据的散点图进行分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，最终结果采用配对样本t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2　结果

2.1　对原血浆标本、2倍稀释度血浆标本及3倍稀释度血浆标本进行PT、APTT检测的结果

将原血浆标本的PT值作为横坐标，将2倍稀释度血浆标本与3倍稀释度血浆标本的PT值作为纵坐标，绘制散点图。结果显示，两种不同稀释度的血浆标本其PT值与原血浆标本的PT值呈线性相关性。用SPSS19.0统计软件对该散点图进行分析后，得到相应的回归方程。其中，2倍稀释度血浆标本的PT值若为x，原血浆标本的PT值若为y，则回归方程为：y=0.835x-1.567（r=0.884，P=0.00）；3倍稀释度血浆标本的PT值若为x，原血浆标本的PT值若为y，则回归方程为：y=0.353x+5.815（r=0.535，P=0.00）。详见图1、图2。

图1　原血浆标本与2倍稀释度血浆标本PT值散点图的对比

图2　原血浆标本与3倍稀释度血浆标本PT值散点图的对比

将原血浆标本的APTT值作为横坐标，将2倍稀释度血浆标本和3倍稀释度血浆标本的APTT值作为纵坐标，绘制散点图。结果显示，两种不同稀释度血浆标本的APTT值与原血浆标本的APTT值呈线性相关。其中，2倍稀释度血浆标本的APPT值若为x，原血浆标本的APPT值若为y，则回归方程为：y=0.538x+4.215（r=0.785，P=0.00）；3倍稀释度血浆标本的APTT值若为x，原血浆标本的APTT值若为y，则回归方程为：y=0.220x+17.816。（r=0.720，P=0.00）。详见图3、图 4。

图3　原血浆标本与2倍稀释度血浆标本APPT值散点图的对比

图4　原血浆标本与3倍稀释度血浆标本APTT值散点图的对比

2.2　对原血浆标本、2倍稀释度血浆标本及3倍稀释度血浆标本进行方法学验证的结果

将2倍稀释度血浆标本及3倍稀释度血浆标本的PT值、APTT值分别代入相应的回归方程中进行换算，并将换算结果与原血浆标本的PT值、APTT值进行配对样本t检验，结果显示，三种血浆标本的PT值、APTT值相比，P＞0.05。详见表1、表2。

表1　对原血浆标本与2倍稀释度血浆标本进行PT、APTT检测结果的对比 （ ±s ）

表1　对原血浆标本与2倍稀释度血浆标本进行PT、APTT检测结果的对比 （ ±s ）

项目　原血浆标本　2倍稀释度血浆标本　t值　P值PT（s）　14.37±1.41　14.37±1.01　0.978　＞0.05 APTT（s） 41.55±5.58　41.52±4.37　0.958

表2　对原血浆标本与3倍稀释度血浆标本进行PT、APTT检测结果的对比 （ ±s ）

表2　对原血浆标本与3倍稀释度血浆标本进行PT、APTT检测结果的对比 （ ±s ）

项目　原血浆标本　3倍稀释度血浆标本　t值　P值PT（s）　14.37±1.41　14.37±0.60　0.975　＞0.05 APTT（s）　41.55±5.58　41.51±3.96　0.950

3　讨论

临床上在进行凝血功能检测时，对血浆标本与抗凝剂的比例有严格的要求。然而，儿童患者及其家属往往对重复进行血浆标本的采集存在抵触的心理，大大地增加了儿科采集合格的血浆标本的难度。比如使用容量为1.8ml的真空抗凝管采集1份血细胞比容在0.550左右的血浆标本，在进行离心处理后得到的血浆标本的含量仅在0.81ml左右。血细胞的比容若再增加，则血浆标本的含量将进一步减少。以STAGO STA-R全自动血凝仪为例。该血凝仪的使用说明要求，在用其进行PT、APTT及FIB检测时，血浆标本的容量须＞0.25ml。而在实际的操作过程中，受仪器探针的运动精度和零部件损耗等因素的影响，所需血浆标本的实际容量必须在0.50ml以上。只有这样，才能确保该仪器的探针能吸入足量的血浆标本，并对每个项目进行正确的检测。

在本次研究中，笔者结合前人的研究经验[7-8]和自身的临床实践，对待检测的血浆标本分别进行了2倍预稀释和3倍预稀释，然后采用稀释回归法测定预稀释后血浆标本的PT值和APTT值，以解决由血浆样本容量较少所带来的无法进行有效检测的问题。本次研究的结果表明，2倍稀释度血浆标本和3倍稀释度血浆标本的PT值、APTT值与原血浆标本的PT值、APTT值相比，P＞0.05。这说明，用稀释回归法对微量血浆标本进行PT、APTT检测的可行性良好，其检测结果可满足一般临床检查的需求。各实验室可依据自身仪器的性能、试剂批号等情况，制定合适的回归方程来解决类似的问题。

需要注意的是，由于参与本次研究的患儿均不存在弥散性血管内凝血（DIC），也未患有其他的凝血障碍性疾病，故是否可用该检查方法对血浆标本量偏少、患有DIC或其他凝血障碍性疾病的患儿进行PT、APTT检测，仍需临床上进行进一步的研究[9]。

[1]彭传梅,高辉,王杨.等.稀释回归法在脂血标本凝血检测中的应用探讨[J].国际检验医学杂志,2016,37(4)：494-495.

[2]熊立凡,刘成玉.临床检验基础[M].北京：人民卫生出版社,2010：72-73.

[3]沈晓明,王卫平.儿科学[M]第7版.北京：人民卫生出版社,2010：92-93,297-298.

[4]从玉隆.临床实验室仪器管理[M].北京：人民卫生出版社,2012：140-141.

[5]张敏,吕洁,吴乾波.CS5100全自动凝血分析仪性能验证[J].实验与检验医学,2016,34(1)：482-484.

[6]赵威,田笑,陈欣,等.STAGO STA-R全自动血凝仪性能验证与评价[J].血栓与止血学,2016,22(1)：74-76.

[7]张翠,毕宇,马晓云.高速离心法和稀释法处理乳糜血对光学法凝血指标检测结果的影响[J].国际医药卫生导报，2016,22(15)：2342-2343.

[8]丁庆莉,虞红燕,王海刚,等.稀释法在消除溶血对凝血检测干扰中的应用[J].临床和实验医学杂志,2013,12(6)：411-412.

[9]许文荣,王建中,等.临床血液学实验[M].第5版.北京：人民卫生出版社,2010：365-370.