全外显子组测序发现一家族性扩张型心肌病致病基因

周年伟　秦胜梅　刘　阳　赵维鹏 　崔　洁 潘翠珍　陈瑞珍　王小林　舒先红

(1上海市影像医学研究所　上海　200032; 2复旦大学附属中山医院心超室,3心内科,4介入治疗科　上海　200032; 5上海市心血管病研究所　上海　200032)

扩张型心肌病(dilated cardiomyopathy ,DCM)主要临床特征是左心室扩大,并伴有左心室收缩功能受损,DCM患者中30%～50%为家族性[1]。目前已确定有40多种基因与家族性DCM发病相关[2]。随着高通量测序技术的进步,全外显子组测序通过外显子捕获技术富集全基因组DNA编码序列,借助二代测序技术进行高效测序分析,全面提供全基因组外显子区域的序列信息,极大促进了遗传性疾病的基因诊断[3]。相较于常规基因panel筛查的方法,全基因组外显子测序大大增强了检测结果的可靠性。故本研究应用二代测序技术对一DCM家系行全基因组外显子测序分析寻找其致病基因。

资 料 和 方 法

研究对象本研究对象为一安徽籍DCM家系(图1)。先证者是一位43岁男性患者(Ⅲ-7,图1),反复心悸、晕厥来复旦大学附属中山医院就诊,初步诊断为心律失常,房室传导阻滞。入院检查心电图提示房颤,三度房室传导阻滞,左束支传导阻滞;超声心动图提示左心房左心室增大伴左心室收缩功能减退,左心室射血分数LVEF=42%。该患者胸片提示心脏扩大(图2);血清肌酸激酶和肌钙蛋白T较正常值稍偏高,既往无高血压、冠心病及糖尿病病史,该患者诊断为DCM,接受了相关药物治疗并植入了起搏器。先证者的表哥(Ⅲ-11,图1),46岁,2年前被诊断为房颤,DCM,也接受了起搏器植入术。

一般临床资料收集该家系所有成员详细的临床资料,包括体格检查、发病年龄、初发症状、血清肌酸激酶、纽约心功能分级、常规心电图及超声心动图,并根据需要行动态心电图检查。所有研究对象签署知情同意书后,采集其外周血标本,按照试剂盒说明书步骤提取基因组DNA。本研究获复旦大学附属中山医院伦理委员会批准(2016-16B),所有研究对象都知情同意并签署知情同意书。

Filled symbols:Patients;Open symbols:Unaffected subjects;Small squares within symbols:Genotype(+)-phenotype (-);Diagonal lines:Death;Arrow:Probands.The presence (+) or absence (-) of the mutation is indicated for the genetically tested family members.

图1扩张型心肌病家系图
Fig1Familydiagramofdilatedcardiomyopathy

A:The electrocardiographic of patients(Ⅲ7) showed atrial fibrillation,complete atrioventricular block and left bundle-branch block.Echocardiogram (B) and chest X-ray (C)showed severe cardiomegaly (arrow).

图2先证者的临床检查资料
Fig2Proband’scardiacexaminationinformation

全外显子组测序本研究对该家系中5位成员(Ⅱ-2,Ⅲ-5,Ⅲ-7,Ⅲ-9 ,Ⅲ-11)的外周血DNA进行全外显子测序实验:样品核酸提取,超声打断,TruSeq DNA Sample Preparation 试剂盒处理两端连接测序接头构建成文库,使用 Roche Nimblegen SeqCap EZ v5.1 试剂盒捕获全外显子区域,采用 illumina XTEN 平台进行高通量测序,数据质量 Q30 比例大于90%,外显子目标区域测序深度中位值>50×,95%目标区域测序深度 >30×,外显子丢失率<0.2%。

测序数据分析基因组测序原始数据经比对分析(bwamem/disco vardenovo/freebayes)取 SNV 及SV 数据;CNV数据使用EulerCNV 及 CNVnator 综合判断;SNV 数据经 in house cohort、 dbSNP138 及 1000G_OMNI2.5 注释携带率,使用 snpEff及 in house 深度神经网络分析流程注释功能;剪切位点预测使用 in house C++/R 深度神经网络模型;CNV/SV 数据经 in house cohort、1000G 及公开 CNV 数据库数据过滤携带率,使用 Langya 注释;信号转导通路分析使用 in house R/Python/Perl package;OMIM/Monarch/ExAC 数据库分析使用in house Perl/R API;表型基因型相关神经网络分析使用Langya/Marshes。数据解读参考美国医学遗传学和基因组学学院(American College of Medical Genetics and Genomics,ACMG)相关指南;变异命名参照 HGVS 建议的规则给出(http://www.hgvs.org/mutnomen/)。

结　　　果

通过对家系患者和正常人全外显子组测序,在数据库中分析比对后发现LMNA基因6号外显子上存在一个杂合无义突变:LMNA,chr1,156105716,c.961 C>T,p.Arg321Ter。既往研究表明LMNA基因突变会引起心电异常传导,心肌收缩活动减弱,心功能出现异常表现。本研究中筛查的基因突变位点在汉族人群中尚属首次报道。既往研究阐明此突变位点引起DCM的机制:无义突变导致LMNA编码蛋白质过程提前终止,相应蛋白质功能不足,进而导致该家系中突变携带者出现心功能异常,因此我们认为LMNAc.961 C>T突变是该DCM家系的致病突变。

基因型与临床表型的验证:我们对参与研究的家系成员通过 Sanger 测序发现心功能临床表现正常的成员(Ⅱ-2,Ⅲ-5,Ⅲ-9)不携带该突变位点,而心功能临床表现异常的成员(Ⅲ-7,Ⅲ-11)携带LMNA杂合突变位点,同时我们对自愿参加基因筛查的子代即Ⅳ-4(男,18岁)、Ⅳ-5(女,22岁)、Ⅳ-6(男,19岁)、Ⅳ-7(男,11岁)、Ⅳ-8(女,14岁)和Ⅳ-10(男,16岁)进行了验证,发现Ⅳ-6、Ⅳ-10为杂合突变,携带此突变位点,符合遗传学规律,由于他们年龄尚小,未到发病的高峰期,目前不能明确临床表型(图3)。

子代Sanger 验证发现Ⅳ-6、Ⅳ-10为杂合突变,其中Ⅳ-6(男,19岁)自述偶尔胸闷气短,心电图、心脏超声检查及其他临床指标提示心功能良好;24 h心电图检查显示:Ⅰ度房室传导阻滞,窦性停搏,全程大于2S停搏485个。Ⅳ-10(男,16岁)自述日常无不适,心电图、心脏超声检查及其他临床指标提示心功能良好;24 h心电图检查显示:偶发房早,室早(多源),Ⅱ、Ⅲ、aVF、V4～V6:ST段自J点抬高>0.1 mv。

c.961 C>T variant on the LMNA gene in the family confirmed by Sanger sequencing.Affected individuals (Ⅲ-7,Ⅲ-11).

图3家系成员突变变位点Sanger测序图
Fig3Sangersequencingofthegenemutationinthefamilymembers

讨　　　论

DCM是以左心室或双心室扩大,心室收缩功能障碍、心室壁变薄为主要特点的一种原发性心肌病,是导致心源性猝死和心力衰竭的主要原因[4]。通过在患者家族中进行相关致病基因的研究发现,家族遗传所占的比例较高。家族性DCM的临床表型存在异质性,携带同一致病基因的家系不同成员之间的临床表现不尽相同,这可能与年龄、性别、基因突变的部位、类型等因素有关[5]。根据以往研究报道统计,由于受限于检测技术以及对DCM整体认识水平,家族性DCM相关致病基因及突变检出率不到30%[6]。经典的Sanger测序法准确性高,但检测序列的长度有限,效率较低,仅适用于筛选已知致病基因突变位点,很大程度上阻碍了DCM的致病基因检测[7]。

随着二代测序技术(next-generation sequencing,NGS)的出现,特别是与外显子组捕获技术相结合的NGS能快速准确地了解基因序列信息,极大地帮助我们了解遗传性疾病,通过对家族相关基因的比对分析,能够较准确地发现致病基因及突变[6]。本研究通过外显子捕获技术富集全基因组DNA编码序列,同时提高了序列覆盖率和热点基因筛选效率,能够较准确地找出相关致病基因。

本研究通过测序分析发现该家系的致病基因为LMNA,其6号外显子Arg321ter是可能的致病性突变,此无义突变导致LMNA编码蛋白质提前终止,进而引起心功能异常。LMNA为1号染色体,分别编码Lamin A 和Lamin C 蛋白质。 这两种蛋白质与LMNB基因编码的Lamin B 蛋白质共同组成细胞的核纤层。核纤层紧贴于内层核膜的内表面,在维持核膜完整性、提供染色体锚着位点、调节细胞的分化及核周期性的解体和重组过程中发挥重要作用[8-9]。动物实验研究发现敲除或者纯合突变LMNA基因的小鼠出生2个月内都会死亡,而杂合突变小鼠的生存期与野生型的相似[10-12]。

LMNA基因的无义突变(c.Arg321ter)导致编码蛋白质提前终止,相应编码的蛋白质功能异常。既往研究证实LMNA基因与核纤层蛋白疾病相关,并且5%～8%的家族性DCM都与此突变有关[13-14]。经数据库检索此位点在汉族人群中尚属首次报道,既往研究证实此突变会导致心功能异常,在已报道携带Arg321ter突变的患者均有类似与传导系统疾病相关DCM的临床表现,这与本研究家系中患者的表现相一致[15-16]。Arg321ter突变转录本可通过无意义密码子介导的mRNA降解途径来遏制截短突变蛋白质的表达,导致相应蛋白质量减少从而引起DCM[17]。此家系子代Sanger 验证发现Ⅳ6、Ⅳ10为携带者,但两者心电图、心脏超声及其他临床指标都无明显异常,均无明显心功能异常表现,后加做24 h心电图显示有房室传导阻滞、窦性停搏等心电活动异常,这主要是由于LMNA基因突变导致的心功能异常的早期表现是心电活动异常,它先于心脏收缩功能,同时这也是由LMNA突变导致的DCM患者容易发生恶性心律失常,甚至猝死的原因。因此,对于家系中的携带者,我们告知其本人及家属存在的潜在风险,注重预防并定期随访,针对心功能出现的异常情况及时给予干预。

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