冻融胚胎移植对妊娠早期胚胎流产率的影响

江成龙，张昌军

(湖北医药学院附属人民医院生殖医学中心，十堰　442000)

玻璃化胚胎冷冻技术是人类辅助生殖技术(ART)的重大进步，与新鲜周期胚胎移植相比，玻璃化胚胎冷冻技术增加了患者胚胎利用率，改善累积妊娠率，减轻患者治疗成本方面起着重要作用[1]。但是关于两者妊娠结局的差异一直存在争议[2-4]。自然流产是ART常见的并发症之一，不但降低抱婴率，还将增加患者夫妇的心理压力和经济负担。因此，重视ART妊娠后流产原因的研究，并采取相应的防治措施，对提高ART治疗最终成功率具有重要的临床意义[5]。本研究回顾分析了2012年1月至2016年12月在本中心接受IVF后行鲜胚和冻融胚胎移植获得临床妊娠的6 834个周期患者的临床资料，比较新鲜胚胎移植与冻融胚胎移植对流产率和活产率的影响。

资料与方法

一、研究对象

回顾分析2012年1月至2016年12月本中心接受IVF-ET及冻融胚胎移植获得临床妊娠的患者的临床资料，共收集6 834个周期。纳入标准：(1)患者年龄21～49岁；(2)不育年限1年～21年；(3)新鲜周期患者均采用GnRH-a长方案；(4)所有患者至少有一枚优质胚胎或者囊胚移植；(5)所有患者均为临床妊娠，即胚胎移植后2周验尿HCG阳性，胚胎移植后30 d宫腔内见孕囊样回声。排除标准：(1)生化妊娠；(2)异位妊娠包括宫内合并宫外妊娠；(3)死产死胎；(4)严重的子宫病变，如子宫粘膜肌瘤、宫腔粘连及子宫畸形；(5)选择性减胎。符合标准的6 834个周期患者根据移植胚胎不同分为鲜胚组和冻胚组。另外根据移植胚胎级别分为卵裂期胚胎移植组(D3组)和囊胚期胚胎移植(D5组)。

二、方法

1.鲜胚组促排卵及新鲜胚胎移植：所有患者均采用GnRH-a长方案垂体降调节[6-7]，降调节达标后每日肌肉注射促性腺激素150～225 IU促排卵，至少2个卵泡平均直径达18～20 mm时注射HCG 5 000～10 000 IU，34～36 h经阴道穿刺取卵，行常规IVF或者卵胞浆内单精子显微注射受精(ICSI)，取卵后72 h或者120 h选择1～3枚胚胎(卵裂期胚胎移植)或者1～2枚囊胚(囊胚期胚胎移植)移植，胚胎移植后肌肉注射黄体酮(浙江仙琚)60～80 mg/d支持黄体。移植14 d验血、尿HCG，移植30 d B超宫腔见孕囊为临床妊娠。

2.冻胚组内膜准备、胚胎复苏及移植：所有冷冻胚胎均采用玻璃化胚胎冷冻技术。拟行冻融胚胎移植患者于月经期采用长效GnRH-a降调节联合激素替代或者激素替代周期准备内膜[8]，当子宫内膜厚度≥8 mm，肌肉注射黄体酮支持黄体(方法同上)，注射黄体酮后72 h(卵裂期胚胎)或者120 h(囊胚期胚胎)，按玻璃化冷冻操作常规解冻复苏胚胎，胚胎移植及妊娠确定同鲜胚组。

3.判定标准：胚胎分4级：1级胚胎，卵裂球大小均匀，无细胞死亡，碎片<10%；2级胚胎：卵裂球大小比较均匀，死亡卵裂球或碎片在10%～20%；3级胚胎：碎片或死亡卵裂球在20%～50%的胚胎；4级胚胎：碎片或死亡卵裂球大于50%的胚胎。1和2级胚胎为优质胚胎。

妊娠的确定：胚胎移植后14 d血清HCG>50 IU/L确定为妊娠。胚胎移植后30 d经阴道B超看到妊娠囊确定为临床妊娠。单胎妊娠或多胎妊娠的确定：根据宫内孕囊数确定。胚胎流失周期数包括流产周期数和活产周期中发生孕卵停止发育的周期数。

4.观察指标及计算方法：种植率=孕囊数/移植胚胎数；流产率=流产周期/妊娠周期；胚胎流失率=(流产周期数+活产周期中发生孕囊停止发育周期数)/妊娠周期数。

三、统计学处理

结　　果

一、患者一般情况比较

统计结果显示，鲜胚组和冻胚组患者的年龄、不育年限、不育原因分布比较差异均无统计学意义(P>0.05)；冻胚组移植胚胎数和种植胚胎数显著高于鲜胚组，差异有统计学意义(P<0.05)(表1、2)。

表1　鲜胚组和冻胚组患者一般情况比较(-±s)

注：与冻胚组相比，*P<0.05

表2　鲜胚组和冻胚组患者不育原因构成(%)

二、患者妊娠结局比较

统计结果显示，鲜胚组的多胎率(双胎和三胎)、胚胎流失率和流产率均明显低于冻胚组，而鲜胚组的种植率和活产率明显高于冻胚组，差异有统计学意义(P<0.05)(表3)。

三、卵裂期与囊胚期胚胎移植结局比较

分别比较D3组和D5组中冻胚和鲜胚患者的移植结局发现，D3组冻胚种植胚胎流失率、流产率和活产率均显著高于鲜胚组，差异有统计学意义(P<0.05)；而D5组患者冻胚组和鲜胚组种植胚胎流失率、流产率和活产率没有显著性差异(P>0.05)(表4)。

表3　患者妊娠结局比较(%)

注：与冻胚组相比，*P<0.05

表4　卵裂期与囊胚期胚胎移植结局比较(%)

注：与同组冻胚组相比，*P<0.05

讨　　论

本研究结果显示冻胚组着床胚胎流失率和流产率显著高于鲜胚组，与方春霞等[4]研究结果类似而与张琦华等[9]研究结果不同，可能是研究样本数的差异。本研究中患者冻胚组胚胎流失率和流产率高可能的原因在于以下几点：(1)冻胚组胚胎移植个数高于鲜胚组，导致种植胚胎数高于鲜胚组，双胎及三胎率显著高于鲜胚组。多胎妊娠是妊娠期胚胎流失及流产的最重要的因素之一，因此减少冻胚移植个数可能有助于减少妊娠早期胚胎流失率。(2)胚胎冷冻可能导致胚胎卵裂球损伤。多个研究表明尽管采用玻璃化胚胎冷冻技术，但是卵裂球损伤仍然是胚胎冻融移植过程中的常见现象。卵裂球损伤可降低胚胎的种植率和妊娠率[10-11]。本研究中冻胚组移植胚胎数高于鲜胚组，但是种植率反而没有鲜胚组高也证明这一点。

本研究结果还显示D3组患者冻胚种植胚胎流失率、流产率和活产率分别为显著高于鲜胚组，而D5组患者冻胚组与鲜胚组流产率和活产率没有显著差异。种植胚胎流失除了包括一般意义上的早期流产外，还包括胚胎移植8周后，B超宫内孕囊容量>2.5 ml，而未见胚芽或者未见心管搏动或者先看到胎心，在随后的B超随访检查时胎心停止搏动(本中心一般会要求患者在孕12周之前至少做2～3次B超)，俗称枯萎孕卵(blighted ovum)[12]。枯萎孕卵既可以单独发生，也可以在多胎妊娠中发生，即孕8周后B超宫腔内见两个或者两个以上的孕囊，但存在一个枯萎孕卵。因此胚胎流失可能发生在有活产的患者，种植胚胎流失率高于流产率。种植胚胎流失降低了种植胚胎的有效利用率(没有换来有效的活产)，严重损害了患者的身心健康。因此要采取一定的措施降低这种种植胚胎流失。有研究表明囊胚对冷冻的耐受能力更强，发生卵裂球损伤的几率更低，冻融囊胚有更高的种植率和临床妊娠率[13-14]。因此将胚胎培养至囊胚阶段冷冻可以减少这种损害，而且可以降低胚胎染色体非整倍体率[15]。本研究中D5组患者鲜胚与冻胚在种植胚胎流失率和流产率上没有显著统计学差异印证了这种观点。

总之，本研究显示与新鲜胚胎移植周期相比，冻融胚胎移植可能会增加妊娠早期胚胎流失率和流产率，降低活产率。囊胚移植组鲜胚与冻胚的流产率没有显著差异，因此在IVF周期中应尽量选择新鲜胚胎移植，如果选择冻融胚胎移植，应尽可能选择冻融囊胚移植。本文为回顾性数据分析，尽管周期数较大，但仍需要多中心前瞻性随机对照研究予以证实。

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