念珠菌类细菌样变异株基因特征初步研究*

王　华，苍金荣，王　曦，刘家云，任健康，苏宝凤，张利侠，闫福堂，归巧娣

(1.陕西省人民医院，a.陕西省临床检验中心；b.检验科，西安　710068； 2.西安市红会医院，西安　710054；3.空军军医大学西京医院，西安　710032)

念珠菌可因生长的微环境和体内某些因素都可能引起念珠菌发生变异，使其培养特性、染色性、形态结构特征、生化反应、耐药性等发生改变[1]，这些生物学性状的改变，会给念珠菌病的实验诊断、临床治疗带来困扰，极易引起误诊或漏诊而贻误治疗。我们将这些念珠菌变异株称之为“念珠菌类细菌样变异株”。对念珠菌发生变异前后生物学性状及遗传学特征进行了深入研究[1～5]发现：念珠菌极易发生类细菌样变异，变异株无论菌落、菌体形态、核结构、生化反应、药敏试验均失去念珠菌固有的生物学特征而与普通细菌的生物学性状酷似。但是其基因特征尚不清楚，为此，我们对这些念珠菌类细菌样变异株的16S RNA序列、真菌18S RNA序列进行了分析比较。

1　材料与方法

1.1材料ATCC10231白色念珠菌标准菌株，源于陕西省疾病预防控制中心；念珠菌类细菌样变异株是白色念珠菌标准菌株在低温、营养缺乏条件或氟康唑诱导下获得。Premix Taq PCR试剂为Takara产品。细菌保守基因序列16S RNA通用引物，扩增片段长度约1 400 bp，引物序列27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，1429R：GGTTACCTTGTTACGACTT；真菌保守基因序列18S RNA通用引物，扩增片断约500bp，引物序列FF：ATTGGAGGGCAAGTCTGGTG，FR：CCGA TCCCTAGTCGGCATAG。上述PCR引物及测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2方法

1.2.1念珠菌变异株的实验室诱导和临床分离：在低温、营养缺乏条件下诱导白色念珠菌标准菌株使其变异；用不同浓度梯度的氟康唑等临床常用抗真菌药物诱导白色念珠菌标准菌株变异。

1.2.2真菌基因模板制备：采用煮沸法制备模板，取培养平板上的菌落于盛有去离子水的1.5 ml离心管中，充分悬浮菌体，置100℃沸水中煮沸10 min，10 000 r/min离心5 min后取上清液2 μl作模板进行PCR扩增。

1.2.3细菌保守基因16S RNA序列的PCR反应体系和参数：细菌保守基因16S RNA序列和真菌保守基因18S RNA序列均采用相同的反应体系和扩增条件：2×Taq PCR MasterMix(Takara公司产品)进行PCR，2×Taq PCR MasterMix 25 μl，模板DNA 2 μl，正向引物F(100 μmol/L) 0.2 μl，反向引物R(100 μmol/L) 0.2 μl，无菌双蒸水22.6 μl，总体积50 μl。PCR参数：在Bio- Rad T100型PCR仪上反应的参数为：94℃预变性5 min，94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，共40个循环；72℃延伸7 min。扩增结束后取PCR产物10 μl在1.2 g/dl琼脂糖凝胶上电泳，观察并记录结果。

1.2.4真菌保守基因18S RNA序列的扩增：采用与16S RNA反应体系和参数相同的条件进行PCR扩增，并对产物进行凝胶电泳分析。

1.2.5细菌保守基因16S RNA测序分析：将细菌保守基因16S RNA扩增片段送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，所得序列进行BLAST(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比对分析。

2　结果

2.1念珠菌类细菌样变异株16S RNA序列扩增阳性念珠菌类细菌样变异株经16S RNA引物扩增及琼脂糖凝胶电泳，发现念珠菌类细菌样变异株16S RNA序列均扩增阳性，而白色念珠菌标准株未出现相应的扩增条带(图1)。表明念珠菌类细菌样变异株基因组中具有16S RNA序列。

E.coli1 2 3 M 4 5Negative

E.coli：大肠埃希菌ATCC25922；M：100～6 000 bp DNA marker (100，250，500，750，1 000，2 000，4 000，5 000，6 000 bp)；1：ATCC10231白色念珠菌标准株；2：ATCC10231白色念珠菌标准菌株，斜面传代- 灰白粗大G+杆菌，类似芽孢状；3：ATCC10231白色念珠菌标准菌株，4℃传代- 黄色G+杆菌；4：ATCC90029白色念珠菌标准菌株氟康唑诱导- 灰白粗大G+杆菌，类芽孢状；5：ATCC90029白色念珠菌标准菌株氟康唑诱导- 灰白粗大G+杆菌，类芽孢状传代- 黄色G+杆菌。

图1念珠菌类细菌样变异株16S RNA基因扩增结果

2.2念珠菌类细菌样变异株18S RNA序列扩增结果念珠菌类细菌样变异株经18S RNA引物扩增及琼脂糖凝胶电泳，发现念珠菌类细菌样变异株除2号菌株有微弱的条带外，其余变异株18S RNA序列均未扩增出目的条带，而白色念珠菌标准株则出现相应的扩增条带(图2)。表明念珠菌类细菌样变异株基因组中18S RNA序列所占比例不多或是因多次传代遗失。

E.coli1 2 3 M 4 5Negative

图2　念珠菌类细菌样变异株18S RNA基因扩增结果

2.3念珠菌类细菌样变异株16S RNA序列比对结果念珠菌类细菌样变异株16S RNA扩增片段经纯化后进行DNA序列测定，BLAST进行比对分析，发现念珠菌类细菌样变异株序列与数据库中细菌序列有较高的相似性，其中2，4分别为内生芽胞杆菌(Bacillus endophyticus)；3，5为假棒形杆菌属(Pseudoclavibacter terrae)。部分菌株的BLAST比对结果见图3。

3　讨论

微生物的鉴定除传统的生化反应外，还可以采用测序方法对包括16S rRNA或18S rRNA等基因进行分析比对。16S rRNA基因是细菌染色体上编码rRNA相对应的DNA序列，约1 542 bp，存在于所有细菌的染色体基因组中。在 16S rRNA 分子中，既含有高度保守的序列区域，又有中度保守和高度变化的序列区域，不同的物种16S 序列具有一定的特异性，常用于细菌分类和进化分析[6]。18S rRNA片段相对比较长，分辨能力也较强。由于片段中含有同源性较强的保守区和变异性较大的可变区，因此利用不同的区域可以进行不同真菌的亲缘关系比对。目前已用于真菌的不同分类级别的鉴定，包括目、科、属的鉴别[6]。

图3　部分念珠菌类细菌样变异株16S RNA序列比对结果

随着人口老龄化及疾病结构的改变，念珠菌已成为机会感染的常见病原菌，以往教科书未见对念珠菌类原核生物样变异方面的记载。目前临床常用的唑类、多烯类抗真菌药物抗真菌机理是与真菌细胞壁的麦角固醇结合而影响其细胞壁的合成，因此，不合理的抗真菌治疗及体内某些因素可能是引起念珠菌发生变异的一个重要因素，这从我们的实验室诱导和临床分离出念珠菌变异株的事实得到验证[1～3]。本次实验中念珠菌类细菌样变异株经18S RNA引物扩增及琼脂糖凝胶电泳，发现念珠菌类细菌样变异株除2号菌株有微弱的条带外，其余变异株18S RNA序列均未扩增出目的条带，而白色念珠菌标准株则出现相应的扩增条带；4号菌株曾经扩增出较强的18S RNA序列条带，经过数年20次传代后再扩增未见此条带，表明念珠菌类细菌样变异株基因组中18S RNA序列所占比例不多或是因多次传代遗失。电镜观察具有明确亲缘关系的念珠菌标准菌株、念珠菌类细菌样变异株、变异菌返祖株在核物质存在形式上确有质的改变，失去真核生物应有的特征，而与原核细胞生物学特性酷似，这种遗传学特征的改变可能是念珠菌发生类原核生物样变异的根源[7]。实验[4]还证实，念珠菌和其类细菌样变异体在条件合适时可在真核细胞与原核细胞之间互变，此研究在生物进化特别是在原核细胞与真核细胞的进化联系上有非常重要的意义，念珠菌很可能是真核生物和原核生物间的一个过渡体。16S RNA和18S RNA序列分析表明，念珠菌类细菌样变异株基因组含有细菌保守基因及少量真菌保守基因，证明具有原核生物学性状的念珠菌类细菌样变异株是源于真核生物的念珠菌。念珠菌类细菌样变异是一个复杂且少有的研究课题，我们期待获得更多分子生物学信息，来进一步阐明原核细胞与真核细胞的进化相互关系。

参考文献：

[1]王华，苍金荣，任健康，等．念珠菌类细菌样变异形态学特征[J]．现代检验医学杂志，2013，28(3)：61- 64，67．

Wang H，Cang JR，Ren JK，et al．Study on morphology of mutable candida like bacteria[J]．JModLabMed，2013，28(3)：61-64，67．

[2]苍金荣，任健康，苏保凤，等．临床分离类细菌样变异念珠菌的实验室诊断[J]．现代检验医学杂志，2009，24(1)：59- 61．

Cang JR，Ren JK，Su BF，et al．J Mod Lab Med，2009，24(1)：59- 61．

[3]苍金荣，王华，任健康，等．变异念珠菌常见菌落和菌体形态[J]．现代检验医学杂志，2011，26(2)：12- 14，18．

Cang JR，Wang H，Ren JK，et al．Variable candida albicans common morphology of colonies and mycelium[J]．J Mod Lab Med，2011，26(2)：12- 14，18．

[4]王华，苍金荣，任健康，等．类细菌样念珠菌变异株真菌保守基因检测[J]．现代检验医学杂志，2011，26(3)：39- 40，43．

Wang H，Cang JR，Ren JK，et al．Detection of conserved gene in bacteria- like canidia albicans variants[J]．J Mod Lab Med，2011，26(3)：39- 40，43．

[5]王华，苍金荣，任健康，等．类细菌样念珠菌变异株对普通抗细菌药物敏感性观察[J]．现代检验医学杂志，2011，26(4)：45- 47．

Wang H，Cang JR，Ren JK，et al．Observation of the sensitivity of bacteria- like candida to normal antibiotics[J]．J Mod Lab Med，2011，26(4)：45- 47．

[6]Karst SM，Dueholm MS，McIlroy SJ，et al．Retrieval of a million high- quality，full- length microbial 16S and 18S rRNA gene sequences without primer bias[J]．Nat Biotechnol，2018，1(1)．doi：10．1038/nbt．4045．[Epub ahead of print]

[7]王华，苍金荣，任健康，等．类细菌样念珠菌变异株生物学形状及遗传学特征研究[J]．现代检验医学杂志，2015，30(4)：47- 49，52．

Wang H，Cang JR，Ren JK，et al．Study on biological characters and genetic characteristics of oidiomycetes mutant strains like bacterial morphology[J]．J Mod Lab Med，2015，30(4)：47- 49，52．