Taqman- 探针荧光定量PCR鉴定副溶血弧菌方法的建立*

侯兵兵，陈昌国，李　娜，赵强元，陈秋圆，刘新萍，董优优

(中国人民解放军海军总医院检验科，北京　100048)

副溶血弧菌(vibrioparahaemolyticus，VP)于1953年最早发现于日本并于1963年正式命名[1]，该菌具有较强的嗜盐性[2]，对人主要引起食物中毒、急性肠炎，少数情况下可引起败血症[3～5]。与沙门菌和志贺菌类似，副溶血弧菌通过食源性途径引起的中毒事件受到广泛关注[6，7]。在我国广东省，副溶血弧菌导致食源性疾病疫情发生率为29.22%，是沿海地区主要的食源性致病菌之一[8]。

副溶血弧菌根据其血清型可分为非致病性菌株和致病性菌株，其中高致病性血清型共有14种[1]。耐热直接溶血素(thermostable direct hemolysin，TDH)基因和TDH相关溶血素(TDH- related hemolysin，TRH)基因是检测副溶血弧菌的常见分子靶点[9，10]，但有报道指出副溶血弧菌分离株中TDH基因和TRH基因有缺失的现象，会造成假阴性结果。副溶血弧菌毒素调控基因(toxin regulations，toxR)是近年来在副溶血弧菌中新发现的毒素调控基因，与副溶血弧菌的致病性有着密切关系，且在弧菌中同源性较低。在本次研究中，我们针对toxR基因相对保守区设计荧光定量引物和Taqman- 荧光探针，建立Taqman- 探针荧光定量PCR检测副溶血弧菌的方法，结果报道如下。

1　材料与方法

1.1实验菌株本实验使用的菌株包括：副溶血弧菌ATCC- VPJS421，溶藻弧菌ATCC- 17749，创伤弧菌ATCC- CMCP6，梅氏弧菌ATCC- Vm8，弗尼斯弧菌ATCC- Vfns1，粪肠球菌ATCC- 29212，金黄色葡萄球菌ATCC- 25293，腐生葡萄球菌ATCC- BAA750，霍氏肠杆菌ATCC- 700323，铜绿假单胞菌ATCC- 27853，大肠埃希氏菌ATCC- 25922，菌株均为本科室保存。

1.2仪器与试剂荧光定量PCR仪为上海宏石公司SLAN- 96P real time PCR System生产，SYBR○RGreen QPCR Master Mix 购自天根生物科技有限公司；引物及Taqman探针由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成，按照引物合成单要求进行后期处理。

1.3方法

1.3.1细菌核酸粗提物制备：将菌种从-80℃冰箱取出后置37℃水浴快速复温，复温后的菌种保存液接种在硫代硫酸盐柠檬酸盐蔗糖琼脂培养基(thiosulfate citrate bile salts sucrose agar culture medium，TCBS)和哥伦比亚血平板上，置37℃孵箱培养12 h。用无菌接种环取适量细菌至1.5 ml离心管中，加入100 μl核酸裂解液后室温裂解15 min，100℃恒温金属浴加热10 min，室温13 000 r/min离心5 min(离心半径=9.5 cm)，取上清作为模板。

1.3.2引物及Taqman- 探针设计：在NCBI网站输入基因名称获取基因序列，运用生物软件Beacon Designer 7和Primer Premier 5.0进行荧光定量PCR引物及Taqman荧光探针设计，探针5’端标记ROX，3’端标记BHQ2。上游引物：5’- CGCTTTCTTCAGACTCAA- 3’，下游引物：5’- CAAGGATTCACAGCAGAA- 3’，荧光探针：ROX- CCTGCTTCTGATAACAATGACGCC- BHQ2。

1.3.3PCR反应体系及扩增条件：取1 μl提取液上清为模板，以toxR特异性引物及Taqman- 探针进行荧光定量PCR检测。PCR反应体系为：2× Mix 10 μl，引物对1μl，Taqman- 探针0.5 μl，模板1 μl，ddH2O 7.5 μl。PCR反应条件为：95℃5 min；94℃20 s～62℃30 s收集荧光，40个循环。

1.3.4引物浓度的优化：上下游引物浓度分别配置成20，15，10 nmol/L工作液进行荧光定量PCR检测，扩增条件同前。

1.3.5探针浓度的优化：合成的荧光探针按照合成单要求加入ddH2O配成母液，然后取5 μl探针母液至95 μl ddH2O中作为工作液。在20 μl PCR反应体系中分别加入1，0.5 μl荧光探针，扩增条件同前。

1.3.6特异度评价：以优化后的反应体系检测副溶血弧菌标准菌株及其他10种细菌的标准株。

1.3.7灵敏度评价：以副溶血弧菌标准菌株系列浓度梯度为模板(102～10- 4mg/L)，每个浓度梯度取1 μl核酸为模板，以优化后的反应体系和反应条件进行荧光定量PCR。以出现典型扩增曲线并在循环数内出现Ct值为阳性。

2　结果

2.1实验参数的优化

2.1.1引物浓度的优化：经过多次实验引物最佳浓度约为10 nmol/L，经2 g/dl凝胶电泳显示引物二聚体较少且扩增效率能够满足实验要求，见图1。

图1　PCR产物2 mg/dl凝胶电泳图

2.1.2探针浓度的优化：实验结果显示，20 μl PCR反应体系中加入0.5 μl荧光探针的反应曲线较体系中加入1 μl荧光探针的效果更好，这与之前研究结果一致[11]，见图2。因此，优化后的副溶血弧菌Taqman- 探针荧光定量PCR反应条件为：20μl体系(ddH2O 7.5 μl，2× Mix 10 μl，模板1 μl，引物对1 μl，探针0.5 μl)。95℃5 min；94℃20 s～62℃30 s收集荧光，40个循环。

图2　不同浓度的探针PCR扩增曲线

2.2Taqman- 探针荧光定量PCR反应体系评价

2.2.1特异度评价：用优化后的反应体系检测副溶血弧菌标准菌株及其他10种细菌的标准菌株，以副溶血弧菌的标准菌株为阳性对照。结果除副溶血弧菌标准株阳性扩增外，其它10种细菌标准株均无阳性扩增。因此，该方法的特异度为100%。见图3～图4。

图3　副溶血弧菌标准株与其他10种细菌PCR扩增曲线

注：1.溶藻弧菌ATCC- 17749；2.创伤弧菌ATCC- CMCP6；3.梅氏弧菌ATCC- Vm8；4.弗尼斯弧菌ATCC- Vfns1；5.粪肠球菌ATCC- 29212；6.金黄色葡萄球菌ATCC- 25293；7.腐生葡萄球菌ATCC- BAA750；8.霍氏肠杆菌ATCC- 700323；9.铜绿假单胞菌ATCC- 27853；10.大肠埃希氏菌ATCC- 259221；11.副溶血弧菌ATCC- VPJS421。

图4副溶血弧菌Taqman- 探针荧光定量PCR特异度检测

2.2.2灵敏度评价：以副溶血弧菌标准株核酸系列稀释样本为模板进行荧光定量PCR，当模板浓度为102～10- 1mg/L时，每个浓度均有典型扩增曲线，当模板浓度为10- 2～10- 4mg/L时，每个浓度未出现典型扩增曲线。所以，本研究建立的方法对副溶血弧菌toxR基因的检测灵敏度为10- 1mg/L，有较好的检测灵敏度。见图5。

图5　副溶血弧菌(ATCC- VPJS421)Taqman- 探针荧光定量PCR灵敏度检测

3　讨论

近年来，随着生物化学、免疫学、微生物学、分子生物学技术的快速发展，目前已经有很多技术用于副溶血弧菌的检测，如细菌培养法、培养基显色法、血清学分型鉴定[12]、酶联免疫吸附试验(ELISA)[13]、电化学发光技术[14]、免疫荧光技术[15，16]、免疫印迹[17]、常规PCR，RAPD- PCR，PCR- ELISA，SYBRGreen荧光定量PCR和多重PCR等。然而，常规分离鉴定操作复杂、费时，不能做到早期诊断；免疫学方法其灵敏度和特异度受限且影响因素较多；常规PCR，RAPD- PCR，PCR- ELISA和多重PCR技术均不能进行定量分析，扩增完仍需凝胶电泳进行鉴定，操作繁琐，同时扩增产物易被污染造成假阳性[12]。Taqman- 探针荧光定量PCR技术是在普通荧光定量PCR基础上加入一条特异的荧光探针，具有更高的特异度[11]。

副溶血弧菌TDH基因、TRH基因、gyrB(DNA回旋酶B亚单位)基因以及16S rRNA等都曾被用做副溶血弧菌检测的分子靶点。其中16S rRNA基因保守性极强，其分化程度不够，在鉴定亲缘关系较近的物种间容易出现假阳性；而TDH基因和TRH基因在引起食物中毒的副溶血弧菌分离株中约30.77%副溶血弧菌为阴性[18]。toxR基因由国外学者近年来在副溶血性弧菌中新发现的致病基因，它在弧菌科内序列非常保守，可表达于所有副溶血弧菌中[2]，并且不同的弧菌种间toxR基因同源性较低[19]。因此，采用副溶血弧菌toxR基因作为检测靶点比tdh基因、trh基因和gyrB基因及16S rRNA具有明显的优势。

本研究针对副溶血弧菌toxR基因设计特异性引物与Taqman- 探针，建立和优化了实时荧光定量PCR反应体系，并对该体系检测特异度和灵敏度进行了评价，检测时间仅需要50 min。2 mg/dl凝胶电泳结果显示，我们设计的引物不但能够扩增出特异性的条带，并且反应完成后引物二聚体较少，能够满足后续添加Taqman- 探针的实验要求；在进行探针浓度优化时，20 μl PCR反应体系中添加0.5 μl荧光探针的Ct值较添加1.0 μl荧光探针的Ct值小且本底荧光较低，能满足实验要求。本研究建立的实时荧光定量PCR反应体系经过上述优化后为评价该检测系统的特异度和灵敏度，我们采用该反应体系对副溶血弧菌标准株及其它10种常见细菌标准株进行检测，仅副溶血弧菌产生阳性扩增，显示出良好的特异度。为进一步探求该反应体系的检测灵敏度，我们将副溶血弧菌标准株核酸定量后进行系列稀释(浓度范围为：102～104mg/L)，发现在核酸浓度为10-1mg/L时能够产生稳定扩增，而10-2mg/L时无稳定扩增，提示该反应体系的检测灵敏度为10-1mg/L。

综上所述，本研究建立的Taqman- 探针荧光定量PCR技术与常规分离培养、常规PCR以及免疫学方法相比，特异度和灵敏度高、检测速度快(检测仅需要50min)，适用于副溶血弧菌的快速检测，在副溶血性弧菌诊断上将具有良好的应用前景和应用价值。

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