贵州地区孕晚期妇女生殖道无乳链球菌定植筛查及CAMP试验阴性的GBS菌株基因测序分析研究*

刘家玲，袁　军，胡方芳　

(1.遵义医学院，贵州遵义　563000；2.贵阳市第二人民医院，贵阳　550001；3.贵州省人民医院，贵阳　550001)

无乳链球菌(streptococcusagalactiae)又称为B群链球菌(group Bstreptococcus，GBS)，定植在孕晚期妇女泌尿生殖道可引起孕妇发生早产、胎膜早破、产褥感染等，在孕妇分娩的过程中经过垂直传播可引起新生儿发生严重的侵袭性感染，如新生儿败血症、脑膜炎、肺炎等[1]。在新生儿感染中有较高致死率、致残率，并且相较其他细菌引起的新生儿感染，GBS感染患儿的住院时间更长，对患儿的家庭经济造成严重负担[2]。因此，对孕35～37周妇女进行常规GBS定植筛查可以有效的预防新生儿感染的发生[3]。为了解贵州地区孕晚期妇女生殖道GBS的定植情况及耐药性，为临床合理用药及预防新生儿GBS感染提供依据。2016年5月～2017年5月收集贵州省人民医院产科门诊孕35～37周妇女生殖道分泌物样本3 794例进行GBS的分离培养鉴定及药敏试验，并对收集到的CAMP阴性的GBS进行了系统化的鉴定，结果报道如下。

1　材料与方法

1.1研究对象连续收集2016年5月～2017年5月贵州省人民医院产科门诊及住院孕35～37周妇女生殖道分泌物拭子。样本采集工作由产科医生完成。

1.2试剂和仪器BD Phinxo100全自动细菌鉴定仪，CO2恒温培养箱(Heal Force HF160W)，哥伦比亚血平板，购自广州迪景；革兰染液，购自BD公司；15 μg/片红霉素、2 μg/片克林霉素，购自英国OXOID；CAMP试验指示菌株为ATCC25923；细菌基因组DNA提取试剂盒及2×Taq PCR MasterMix购自天根生物；100bp DNA Lander 购自Takara；GoldView II型核酸染色剂购自SolarbioTM科技有限公司；琼脂糖凝胶(Regular AGAROSE G- 10)购自BiowestTM科技有限公司；BIO- RAD T100TMThermal Cycler PCR扩增仪。

1.3方法

1.3.1分离鉴定体外药敏试验及大环内酯类耐药表型检测：将收集到的孕晚期妇女生殖道拭子接种于哥伦比亚血平板，置于35℃，5 ml/dl CO2培养箱中孵育18～24 h。挑取可疑菌落分离纯化后进行革兰染色镜检及触酶试验，对革兰染色呈阳性球菌、触酶试验阴性者做CAMP试验，同时应用BD Phinxo100全自动细菌鉴定仪及配套的链球菌鉴定及药敏卡进行细菌鉴定及药敏试验，纳入的药物包括：青霉素、红霉素、克林霉素、万古霉素、头孢吡肟、头孢噻肟、左氧氟沙星、氯霉素、阿莫西林、利奈唑胺。按照CLSI(2016版)标准用常规纸片扩散法对仪器检测药敏结果为红霉素耐药、克林霉素敏感的菌株进行D试验。将15 μg/片的红霉素、2 μg/片的克林霉素贴在相邻的位置，间距12～15 mm，35℃ 5～10 ml/dl CO2孵育18～24 h，红霉素耐药，靠近红霉素纸片处克林霉素抑菌圈截平呈D形抑菌环，报告D试验阳性。

1.3.2CAPM试验阴性菌株的16SrDNA序列分析鉴定：收集到的CAMP试验阴性的GBS，参考Hongoh等[4，5]报道，扩增16srDNA引物。引物序列为：27F： 5’- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG- 3’；1492R：5’- GGTTACCTTGTTACGACTT- 3’。将分离到的菌株进行细菌基因组DNA提取后作为模板进行16SrDNA扩增，目的片段大小为1 540 bp。PCR反应体系25 μl：2×Taq MasterMix 12.5 μl，模板1 μl，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μl，ddH2O 9.5 μl。PCR反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸2 min，35个循环；72℃稳定10 min。PCR产物经南京金斯瑞生物科技有限公司测序，将测序结果提交到GenBank数据库进行比对分析。利用MEGA 5.0软件对同源相近的链球菌的16SrDNA序列构建进化树。

1.3.3cfb基因检测：参考文献中报道的编码CAMP因子的cfb基因引物[5，6]，引物序列cfbF：5’- ATGATGTATCTATCTGGAACTCTAGTG- 3’；cfbR：5’- CGCAATGAAGTCTTTAATTTTTC- 3’，对分离得到的CAMP试验阴性的菌株进行cfb基因的检测，预期的目的片段大小为260 bp。PCR反应体系25 μl：2×Taq MasterMix 12.5 μl，模板1 μl，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μl，ddH2O 9.5 μl。PCR反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸2 min，35个循环；72℃稳定10 min。PCR产物经含有EB的1.0 g/dl琼脂糖凝胶电泳后在紫外凝胶成像系统下观察是否有特异性条带，后由金斯瑞(南京)生物科技有限公司测序，将测序结果提交到GenBank数据库中进行在线比对分析。

1.3.4质量控制：质量控制菌株使用肺炎链球菌ATCC49619，仪器和试验质量控制均在控。

1.4统计学分析使用whonet 5．6软件对药敏结果进行数据统计。

2　结果

2.1无乳链球菌的分离率、耐药性及耐药表型3 794份样本共分离出无乳链球菌118株，检出率为3.11%。118株GBS的药敏结果显示对青霉素、万古霉素、阿莫西林、头孢吡肟和头孢噻肟的敏感度均为100%，对红霉素、克林霉素、左氧氟沙星、氯霉素分别有不同程度的耐药，其耐药率依次为：81.3%，62.7%，72.9%，21.2%。118株菌中对红霉素和(或)克林霉素耐药的菌株为99株，其中红霉素和克林霉素同时耐药的74株，即cMLS型74.7%；对红霉素耐药、克林霉素敏感的25株；共25株菌进行大环内脂类抗生素耐药表型(D试验)的检测。D试验阳性13株，阳性率52%，即表现为克林霉素诱导性耐药表型13.1%；余下12株菌为D试验阴性，即MS型12.1%。

2.2CAMP阴性GBS菌株的菌落形态、生化试验、耐药性及大环内酯类抗生素耐药表型结果118株GBS中1株为CAMP试验阴性，全自动细菌鉴定仪鉴定为GBS，将该菌命名为GZ2058。该菌在血琼脂平板上生长为灰白色半透明湿润菌落，呈β- 溶血，革兰染色为阳性球菌，触酶试验为阴性，CAMP试验靠近指示菌株(ATCC25923)的一端未见“伞状”溶血区域；该菌的药敏试验结果为：对青霉素、阿莫西林、头孢噻肟、头孢吡肟、利奈唑胺、万古霉素表现为敏感；对氯霉素、红霉素、克林霉素、左氧氟沙星表现为耐药。该菌的大环内酯类抗生素耐药表型为cMLS型。

2.3CAMP阴性GBS菌株16SrDNA序列分析及cfb基因检测GZ2058菌株的16SrDNA序列提交到GenBank，获得登陆号：MG386601在线比对分析与无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)同源性为100%。进化树分析结果显示GZ2058与无乳链球菌聚为一类，见图1。GZ2058的cfb基因PCR扩增产物进行凝胶电泳后成像可见大小约为260 bp的目的条带，见图2。BLAST分析结果显示，扩增序列与无乳链球菌的cfb基因同源性为100%。

图1　GZ2058 16SrDNA序列系统进化树

图2　CAMP阴性的无乳链球菌(GZ2058)cfb基因的检测结果

3　讨论

1887年无乳链球菌第一次被报道在牛乳腺炎中分离得到，50年后第一次发现无乳链球菌可引起严重的新生儿感染。随后人们对无乳链球菌进行了大量的研究证实：无乳链球菌感染的孕妇可发生早产、胎膜早破、晚期流产等不良妊娠结局，同时孕妇在分娩的过程中可感染新生儿发生早发型或晚发型新生儿感染性疾病。其致病机制主要是通过分泌各种黏附因子(如层黏蛋白结合蛋白、纤维蛋白原结合蛋白、丝氨酸重复蛋白、免疫原性细菌黏附蛋白、αC蛋白等)黏附于宿主细胞表面侵入细胞内分泌各种毒力因子(如CAMP因子、细胞溶血素、荚膜多糖等)而致病[7]。本研究收集了3 794例孕晚期妇女生殖道分泌物样本，共培养出118株无乳链球菌，分离率约3.11%，低于杨淋等[8～11]报道的贵州省铜仁地区孕妇的带菌率10.7%[8]，深圳地区12.0%，福建地区19.7%，广州地区6.33%。国外研究显示在肯尼亚、南非GBS在孕妇生殖道中的携带率为14.3%～10%[12]；在欧洲孕妇生殖道标本GBS携带率为6.5%～36%[13]。这可能与无乳链球菌在孕妇生殖道定植的地区、民族差异等有关。此外，不同的筛查方法结果不同：采用肉汤增菌、GBS显色培养基、PCR检测可以提高GBS检出率，但相对费用较高，且PCR方法也不能100%检出GBS，也存在假阴性结果[14]。本研究对无乳链球菌的培养筛查的方法使用血平板直接接种样本进行细菌培养，样本采集方法及转运过程对培养的结果会有一定的影响，可能会导致分离率降低。

本研究中检出1例CAMP阴性的无乳链球菌，在血琼脂平板上该菌为灰白色、湿润半透明菌落，有狭窄β- 溶血环，这与临床实验室常见的无乳链球菌的菌落形态十分相似，但该菌CAMP试验为阴性，经16SrDAN序列分析证实该菌与无乳链球菌同源性为100%。目前国内尚无研究报道发现人源性CAMP阴性的无乳链球菌，此为首例，仅见一例分离自罗非鱼中的γ- 溶血的无乳链球菌的相关报道[5]。CAMP因子是一种具有穿孔性能的分泌性蛋白，可与人类的IgG，IgM的Fc段结合启动免疫应答反应而被认为是无乳链球菌的毒力因子之一。在活体动物试验中已经证实：纯化的CAMP因子可导致兔子及小鼠死亡[15，16]，但Mary 等[17]人通过对CAMP因子编码基因cfb进行等位基因替换后的体外及体内试验研究认为CAMP因子在GBS的毒力系统中不是必须的。1944年Christie等人第一次报道，认为CAMP因子对无乳链球菌有很高的特异性，可与金黄色葡萄球菌的神经鞘磷脂酶产生协同作用，可形成伞状的透明溶血区域，称为CAMP试验阳性，此后广泛的被临床实验室用作无乳链球菌的重要鉴定试验。1979年CAMP因子由Bernheimer等人分离纯化。1994年其编码基因cfb被人们发现。后续的研究显示几乎所有的无乳链球菌都含有编码CAMP因子的编码基因cfb，但仍有研究报道显示确实存在CAMP阴性的表现型无乳链球菌[18]，且目前认为绝大多数(>98%)的无乳链球菌都含有CAMP的编码基因cfb基因，CAMP阴性的菌株可能与cfb基因的突变有关[19]。本研究中GZ2058经检测其基因组中含有cfb基因，这与Hassan等[18]人的报道一致。近年来国外研究证实无乳链球菌含有21个双信号传导系统(two- component signal transduction system，TCS)，主要参与无乳链球菌的新陈代谢及毒力因子的表达调控，其中CovR/S是无乳链球菌中重要的毒力因子相关基因的调控元件，包括CAMP因子编码基因cfb及细胞溶血素的编码基因cylE等，在CovR/S突变的GBS菌株，特别是CovR缺失的菌株中可看到GBS的β- 溶血素及各黏附素的活力增加，但CAMP因子的活性下降的现象[20，21]，因此GZ2058有可能是由于CovS/CovR的突变导致的CAMP阴性的菌株，但也不排除是由于cfb基因突变导致的CAMP阴性的可能。本研究中人源性CAMP阴性的无乳链球菌的检出给临床微生物检验工作一个警示，CAMP试验对于无乳链球菌的鉴定不是100%，CAMP阴性的无乳链球菌可在孕妇的生殖道定植，在临床检验的工作中仍然需要从多方面去完善其鉴定流程，避免漏检。

2010年美国CDC推荐将青霉素作为GBS阳性孕妇的首选用药，在分娩前每4 h静脉滴注1次直至生产，予以预防经产道分娩的新生儿发生GBS感染，对青霉素过敏的孕妇，推荐使用大环内酯类抗生素红霉素和林克酰胺类抗生素克林霉素，并且应加做D试验检测红霉素对克林霉素诱导的诱导性耐药的菌株。随着抗生素滥用，细菌对某些药物呈现高度耐药的情况在本研究中的118株无乳链球菌中也得到证实。其中耐药率最高的药物为红霉素(82.2%)，其余依次为左氧氟沙星(72.9%)、克林霉素(62.7%)，耐药率均高于全国其他地区[8，10，11，22]。此外，近年日本有研究报道发现了青霉素敏感度降低的GBS菌株，并且此类菌株的检出率从2006年的2.3%上升到2013年的14.7%[23]。在国内，仅见北京地区和广州地区有报道分离出了对青霉素和氨苄西林呈现中度敏感的菌株，并且检出率为17.0%[24]。但在本研究中未发现青霉素耐药或者敏感性降低的菌株，对此青霉素仍然可作为本地区预防及治疗新生儿GBS感染的首选用药。iMLS表型表现为对红霉素耐药，对克林霉素敏感或中介，且仪器检测的药敏结果无法判断红霉素和克林霉素之间的诱导性耐药关系，本研究中D试验阳性率为52%，高于周燕珍等[25]人的报道，这可能与无乳链球菌的血清型、表面蛋白、耐药基因及地域分布的差异有密切的关系。为避免临床不合理用药的发生，临床实验室应常规进行D试验，对D试验阳性，克林霉素检测结果为敏感的菌株将报告修正为耐药，以正确指导临床合理用药。

综上所述，目前国内无乳链球菌对孕妇及新生儿的健康威害日益被重视，孕晚期妇女生殖道无乳链球菌定植的筛查应纳入孕妇产前检查的常规检查项目，并且在有条件的地区应优化检验流程及检验方法提高检出率，虽然CAMP阴性的GBS菌株极为少见，并且此类菌株相关的文献数据较少，关于其表现为CAMP阴性的具体原因及在临床感染中的致病性也尚不明确，但仍然建议临床实验室在日常的微生物检验工作中格外留意，避免此类菌株的漏检。同时加强对GBS耐药菌株的耐药监测及管理。

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由于外界温度过高以及长时间接受暴晒，牛羊极易出现日射病，并有可能引发光照性皮炎；同时，由于外界环境的湿度以及温度过高，极易导致牛羊患热射病；在大气温度变化较为明显时，例如突然升高或者突然降低，可能会导致牛羊患呼吸道疾病或者感冒等；基于地表泥泞、降水多等的影响，夏季牛羊患腐蹄症的可能性也较高。

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