KU55933对化疗后胶质母细胞瘤细胞株U87增殖、凋亡的影响及其机制探讨

王倩，蔡炜嵩

(中国医科大学附属盛京医院，沈阳 110000)

脑胶质瘤是颅内常见的原发性肿瘤，约占颅内肿瘤的30%；其中WHO Ⅳ级的恶性胶质母细胞瘤(GBM)约占胶质瘤的50%，且恶性程度高，预后差，中位复发期为7个月，中位生存时间12～14个月。NCCN指南推荐行最大范围手术切除，术后行病灶区放疗同步及辅助替莫唑胺(TMZ)化疗。TMZ为DNA烷化剂，是针对GBM的一线化疗药物，可以通过血脑屏障。然而，GMB容易对放化疗耐受，即使大剂量放化疗同样易于复发[1]。研究[2,3]显示，肿瘤对治疗抵抗多与细胞周期时相、细胞周期检查点及DNA损伤修复相关。共济失调毛细血管扩张突变基因(ATM)功能缺陷可导致共济失调毛细血管扩张症，其可表现出对放疗敏感性增加[4]。ATM/ATR基因在促进肿瘤细胞耐细胞毒性治疗方案中起核心作用，其可引起细胞周期阻滞，促进DNA修复，维持基因组稳定性。ATM/ATR阻滞剂可提高GBM细胞放疗敏感性[5]。KU55933为经典的ATM阻滞剂，KU55933联合放疗可使放疗引起的细胞周期阻滞消失[6,7]。本研究观察了KU55933对化疗后U87细胞增殖、凋亡的影响，并探讨其机制。

1 　材料与方法

1.1ATM/ATR阻滞剂、药物、细胞及试剂KU55933购于美国Selleck公司；TMZ购于默沙东制药公司；U87细胞为本实验室保存；DMEM培养基购于Hyclone公司，标准胎牛血清购于天晴灏洋生物制品科技有限公司，DMSO购于美国Sigma公司，细胞周期检测点激酶1(Chk1)、细胞周期检测点激酶2(Chk2)、磷酸化Chk1(pChk1)、磷酸化Chk2(pChk2)、细胞周期蛋白B(Cyclin B)、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)多克隆抗体购自博士得公司。

1.2 U87细胞培养 细胞用高糖DMEM培养基(含 10%胎牛血清)培养基培养，37 ℃恒温培养箱内生长。当细胞长满培养瓶底85%或接近汇合成片时开始传代，每隔2～3天换液1次，至对数生长期再传代。

1.3 KU55933对U87细胞增殖能力影响观察 采用CCK-8法。取传3代对数生长期U87细胞，0.25%胰酶消化，加入含10%FBS的DMEM培养液稀释，制备成单细胞悬液，接种于96孔板中，接种密度为3×104/mL。后随机分为KU55933组、替莫唑胺组、空白组，每组设3个复孔。置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中常规培养。KU55933组细胞隔夜后加入10 μmol/L的KU55933，1 h后加入50 mg/mL的替莫唑胺(TMZ)；替莫唑胺组细胞隔夜后加入50 mg/mL的TMZ；空白组不特殊处理。3组分别于24、48、72 h后更换培养基100 μL/孔，每孔加CCK-8溶液10 μL孵育2 h终止培养，在酶标仪上测定460 nm波长处各孔OD值，以此表示U87细胞的增殖情况。实验重复3次，取平均值。

1.4 KU55933对U87细胞凋亡能力影响观察 采用流式细胞术。实验分组及处理方法同1.3，培养后取传3代对数生长期U87细胞，用不含EDTA的胰酶消化收集。PBS洗涤细胞2次(800 r/min离心5 min)收集1×105～5×105细胞；加入500 μL的Binding Buffer悬浮细胞；加入5 μL Annexin V-FITC混匀后，加入5 μL Propidium Iodide，混匀；室温、避光、反应5～15 min；用流失细胞仪和Flowjo软件测算各组培养48 h后的细胞凋亡率。实验重复3次，取平均值。

1.5 KU55933对U87细胞ATM/ATR下游通路蛋白表达影响观察 采用Western blotting法。实验分组及处理方法同“1.3”。各实验组处理48 h后，加入0.25%胰酶消化收集各组U87细胞，PBS洗涤2次后离心。加入已经添加蛋白酶阻滞剂的RIPA细胞裂解液，收集上清并检测蛋白浓度。BCA法蛋白定量合格后，移至EP管中，加入等量上样缓冲液，100 ℃水浴5 min，行SDS-PAGE，并转印至PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭2 h，分别加入Chk1、pChk1、Chk2、pChk2、Cyclin B、Cyclin D1、Caspase抗体，4 ℃孵育过夜；PBS冲洗3次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温振荡孵育2 h；PBS冲洗3次，ECL显色，凝胶成像分析系统采集图像。以GAPDH为内参，以目的蛋白电泳条带灰度值与GAPDH蛋白电泳条带灰度值的比值作为目的蛋白的相对表达量。实验重复3次，取平均值。

2　 结果

2.1各组细胞OD值比较 细胞OD值比较见表1。

表1　培养不同时点各组细胞OD值比较

注：与空白组比较，#P<0.05；与替莫唑胺组比较，*P<0.05。

2.2各组细胞凋亡率比较 KU55933组、替莫唑胺组、空白组细胞凋亡率分别为23.36%±0.56%、12.76%±0.25%、5.58%±0.36%，KU55933组、替莫唑胺组与空白组比较，KU55933组与替莫唑胺组比较，P均<0.05。

2.3各组细胞ATM/ATR下游通路蛋白相对表达量比较 细胞ATM/ATR下游通路蛋白相对表达量比较见表2。

表2　各组细胞ATM/ATR下游通路蛋白相对表达量比较

注：与空白组比较，#P<0.05；与替莫唑胺组比较，*P<0.05。

3　 讨论

GMB在脑瘤中很常见，术后复发率高，其对于辐射或化疗药物抗拒导致治疗失败是个世界性难题。TMZ为一线治疗药物，通常应用于同步及辅助化疗。研究[8]认为，细胞凋亡是TMZ导致细胞毒性的主要机制。TMZ可导致细胞双链DNA断裂，诱导细胞周期G2/M期阻滞，从而导致其发生凋亡[9]。化疗耐药是造成GMB治疗失败的主要原因。关于化疗耐药机制的研究主要集中在多个方面，如MSH6错配修复基因、低氧诱导对细胞毒性药物的抵抗、细胞骨架重排、肿瘤干细胞学说等多个方面[10～13]。由于细胞周期阻滞与DNA的修复与细胞辐射敏感性的密切关系，ATM/ATR通路逆转细胞周期阻滞，促进DNA的修复使细胞避免凋亡，导致TMZ化疗耐药，故该通路可能成为化疗敏感性研究的一个切入点。本研究显示，KU55933组、替莫唑胺组24、48、72 h的OD值较空白组减，KU55933组24、48、72 h的OD值较替莫唑胺组减少；KU55933组、替莫唑胺组细胞凋亡率较空白组增加，KU55933组细胞凋亡率较替莫唑胺组增加。提示KU55933可抑制化疗后U87细胞的增殖，促进其凋亡。

ATM/ATR基因属于DNA修复基因，在细胞周期调控、DNA损伤识别和修复中处于关键位置。而Chk1和Chk2是细胞周期检测中最为关键的效应酶。DNA损伤后，ATM/ATR立即被激活，作用于下游底物引起细胞周期阻滞并激活DNA修复系统，与细胞周期检测点相互协调以维持基因组稳定性，使细胞能够正常增殖分化，避免凋亡，以应对离子辐射以及一些免疫抑制药物造成的DNA损伤[14]。以上极有可能为癌细胞抗拒放化疗的通路之一。Crescenzi等[15]指出，ATM为固定早衰表型所必需基因，从而使癌细胞即使暴露于细胞毒性药物中仍可存活，导致耐药。因此，若我们人为的抑制ATM/ATR蛋白，阻断Chk1、Chk2磷酸化，从而阻断上述通路，可能逆转抗药。文献[16]报道，KU55933可提高肿瘤对放化疗的敏感性。DNA损伤修复的信号传导过程中的一个重要过程即为细胞周期阻滞，Chk1和Chk2在细胞周期检测中发挥极其重要的作用，主要调节S期和(或)G2/M期检测点，抑制Chk1和Chk2激活或蛋白表达，可有效消除肿瘤细胞在放射线或化疗药物作用后的细胞周期阻滞，增加放化疗的敏感性[17]。文献[18]报道，恶性黑素细胞肿瘤在接受一定剂量的射线照射后发生G2/M期阻滞，细胞Cyclin B1表达减少。而Cyclin D是细胞周期运行的起始因子，其在G1早期表达增加，与细胞中的CDK4和CDK6结合，通过Cyclin D-CDK4/CKD6通路调控细胞越过G1期细胞检测点[19]。综上，我们选取检测Chk、pChk蛋白变化明确ATM/ATR抑制后其下游因子的变化，尤其pChk蛋白的减少提示细胞损伤修复的减少，而Cyclin B及Cyclin D作为细胞周期蛋白，可调控细胞周期阻滞，其表达升高可导致细胞阻滞于G2/M、S期，利于DNA损伤修复；而其表达降低可解除细胞阻滞于G2/M、S期，促进细胞凋亡。Caspase-3作为凋亡蛋白，其水平变化可反映细胞凋亡情况。本研究显示，KU55933组和替莫唑胺组pChk1、pChk2、Cleave-Caspase-3相对表达量较空白组升高，Cyclin B、Cyclin D1相对表达量较空白组降低；KU55933组pChk1、pChk2、Cyclin B、Cyclin D1相对表达量较替莫唑胺组降低，Cleave-Caspase-3相对表达量较替莫唑胺组升高。提示KU55933可解除化疗损伤带来的细胞周期阻滞，使细胞损伤修复减少，进而细胞凋亡增多，提高了化疗敏感性。

总之，ATM/ATR阻滞剂可通过下调磷酸化Chk，进一步下调Cyclin B及Cyclin D1表达，从而逆转细胞周期阻滞，阻止DNA通过该通路进行损伤修复，促进细胞凋亡，从而提高GMB细胞对化疗的敏感性。

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