癫痫大鼠海马组织髓鞘相关蛋白MBP、MAG表达变化及意义

李世容，王龙，刘蕊，李玫，瞿浩，顾然，胡晓

(1贵州省人民医院，贵阳550002；2皖北煤电集团总医院)

癫痫是神经系统常见疾病，我国约有1 000万癫痫患者，其中约30%为难治性癫痫[1]。研究显示，脱髓鞘或脱髓鞘再生障碍在癫痫的发病中具有关键作用。我们的前期研究显示，由少突胶质细胞(OL)产生的髓鞘碱性蛋白(MBP)和髓鞘相关糖蛋白(MAG)介导的脱髓鞘或髓鞘再生障碍与癫痫发作存在一定相关性[2]。但前期研究仅局限于癫痫发病后一个时间点的观察，而对髓鞘相关蛋白在癫痫发作不同时期的具体表达情况未进行深入研究。我们以癫痫大鼠模型为研究对象，探讨髓鞘相关蛋白MBP、MAG在癫痫发作不同时期的变化情况，以期为临床诊疗提供理论依据。

1　材料与方法

1.1　材料

SPF级健康雄性12周龄SD大鼠40只，体质量200～220 g，购自贵州医科大学动物实验中心。在温度控制室内饲养大鼠，昼夜各12 h，自由进食、水。BL-420S型生物多媒体计算机刺激记录系统(成都泰盟科技有限公司)，微型颅骨钻、大鼠脑立体定位仪68505(深圳瑞沃德生命科技有限公司)，双极漆包镍铬电极(直径0.1 mm、尖距0.025 mm，上海鼎皋公司)。RNAiso Plus、RT逆转录试剂盒、SYBR Master Mixture试剂盒(大连TaKaRa公司)。

1.2　动物分组与模型制备

采用随机数字表法将大鼠分成正常组、实验1组、实验2组、假手术组各10只。正常组正常饲养。实验1组、实验2组大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，固定于大鼠脑立体定位仪，暴露颅骨及前囟。根据Konig图谱确定大鼠右侧杏仁核位置，于前囟后3.0 mm右侧旁开4.8 mm颅骨表面下8.8 mm处插入电极固定。术后恢复1周，采用生物多媒体计算机刺激记录系统刺激杏仁核行杏仁核点燃实验。刺激参数：细电流、串刺激、波宽1 ms，频率60 Hz，持续时间1 s，强度0.450 mA，1次/d。每次电刺激停止时立即观察大鼠痫性行为，采用视频监控记录大鼠自发性反复癫痫发作情况。按Racine分级方法[5]进行行为学评价。1级：面部阵挛，包括动须，咀嚼等；2级：1级发作行为加节律性点头；3级：2级行为加前肢阵挛；4级：3级行为加后肢站立；5级：4级行为加摔倒。4级及以上为成功诱发癫痫。实验1组、实验2组各7只成功诱发癫痫。假手术组仅安装电极不刺激杏仁核诱发癫痫。

1.3　干预方法

实验1组和实验2组诱发癫痫后均不再给予刺激。实验1组以诱发癫痫后至3 h作为癫痫急性惊厥发作期；实验2组以诱发癫痫后至30 d作为癫痫慢性惊厥发作期，观察大鼠自发性反复癫痫发作情况。假手术组仅安装电极不诱发癫痫。正常组正常饲养，不进行干预。

1.4　标本采集

正常组在正常饲养7 d，假手术组在安装电极术后7 d，实验1组在诱发癫痫后3 h，实验2组在诱发自发性反复癫痫发作后30 d分别断头处死。用咬骨钳咬合并逐渐暴露双侧大脑半球，快速取下大脑组织置于冰块上，用眼科镊子分离出新月形海马组织。一部分海马组织用于病理HE染色及MBP、MAG mRNA表达检测；另一部分-80 ℃保存，用于MBP、MAG蛋白表达检测。

1.5　海马组织MBP、MAG mRNA表达检测

采用RT-qPCR法。先用RNAiso Plus提取新鲜海马组织样本总RNA，用RT逆转录试剂盒逆转录为cDNA。用SYBR Master Mixture试剂盒进行RT-qPCR实验。以β-actin作为内参，设计并合成引物。引物序列：MBP上游5′-CCCATTGGTGCACACTAACCTC-3′，下游5′-CGACTTGATTCAGCGACAGGA-3′；MAG上游5′-GCGGCTACAACCAGTACACCTTC-3′，下游5′-CACCATGCAGCTGACCTCTACTTC-3′；β-actin上游5′-CTGCCCTGGCTCCTA-3′，下游5′-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3′。扩增条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性10 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，共40个循环；72 ℃延伸10 min。读取基因扩增的Ct值，采用2-ΔΔCt法计算MBP、MAG mRNA的相对表达量。

1.6　海马组织MBP、MAG蛋白表达检测

采用Western blotting法。将海马组织从-80 ℃冰箱取出，迅速研磨成粉末。加入细胞裂解液提取细胞总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度。蛋白上样于制好的SDS-PAGE上，电泳后转移至PVDF膜。5%脱脂奶粉-TBST封闭1 h后，加入一抗(1∶1 000稀释)4 ℃孵育过夜。洗膜，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG二抗(1∶5 000稀释)，室温孵育1 h。TBST漂洗后Odyssey红外成像仪扫描PVDF膜。采用的Image J和IPP6.0软件对电泳条带进行灰度值分析。

1.7　统计学方法

2　结果

2.1　海马组织病理生理变化

正常组海马CA1区锥体细胞呈多层排列，结构清晰，细胞排列整齐紧密、分布均匀，神经细胞数目多、外形规则；细胞层可分3～5层，胞核圆形或椭圆形，染色较淡，染色质均匀，核膜边界清晰，核仁圆且明显。假手术组海马CA1区锥体细胞排列整齐，层次清晰，分布均匀，神经细胞数目多、外形规则;细胞层可分3～5层，胞核圆形或椭圆形，染色较淡，染色质均匀，核膜边界清晰，核仁圆且明显。实验1组海马CA1区锥体细胞排列较整齐紧密，胞核圆形或椭圆形，染色较淡，染色质均匀，核膜边界清晰，核仁圆且明显。实验2组海马CA1区神经细胞层次变少，数量减少，排列紊乱、稀疏；部分神经细胞核深染、固缩，呈杆状或三角形，核仁不明显，细胞周围间隙增大。

2.2　各组海马组织MBP、MAG mRNA表达水平比较

假手术组、实验1组、实验2组脑海马组织MBP、MAG mRNA表达均较正常组降低(P均<0.05)；实验1、2组较假手术组降低(P均<0.05)，实验2组较实验1组降低(P均<0.05)。见表1。

表1　各组MBP、MAG mRNA表达水平比较

注：与正常组比较，*P<0.05；与假手术组比较，△P<0.05；与实验1组比较，#P<0.05。

2.3　各组海马组织MBP、MAG蛋白表达比较

假手术组、实验1组、实验2组脑海马组织MBP、MAG蛋白表达均较正常组降低(P均<0.05)；实验1、2组较假手术组降低(P均<0.05)，实验2组较实验1组降低(P均<0.05)。见表2。

表2　各组MBP、MAG蛋白表达比较

注：与正常组比较，*P<0.05；与假手术组比较，△P<0.05；与实验1组比较，#P<0.05。

3　讨论

癫痫是大脑神经元反复、无规律发作、同步异常放电导致脑功能紊乱的神经系统疾病，具有诊断困难、病情反复、治疗效果较差等特点，严重影响患者生活质量并增加患者及家庭经济负担。目前普遍认为，脱髓鞘或髓鞘再生障碍在癫痫发病中发挥关键作用。研究发现，当髓鞘基因突变大鼠行为出现震颤和癫痫时，其脑电监测可同时出现癫痫样放电[4]，病理学可见脑组织有髓神经纤维的数量及直径减少，故认为髓神经纤维的变化可导致异常放电，从而诱发癫痫[5]。OL作为中枢神经系统(CNS)神经元髓鞘形成细胞，其成熟分化是中枢髓鞘形成的关键，OL分化异常严重影响OL正常功能，导致髓鞘脱失及有髓鞘神经纤维减少影响电传导，从而诱发癫痫。反复癫痫发作易产生惊厥性损伤，如得不到及时修复和控制，可形成局部病灶进一步加重癫痫发作，提示OL分化异常与癫痫发作密切相关[6]。Reeves等[7]证实，癫痫患者脑组织中髓鞘相关蛋白表达降低与髓鞘脱失相关，且癫痫发作后存在OL增生及中枢神经髓鞘脱失等病理变化，认为OL在癫痫病理过程中发挥重要作用。因此,OL分化异常及髓鞘损伤与癫痫发作相关性值得关注。

OL分泌抑制性蛋白MBP、MAG。MBP是CNS髓鞘含量最丰富的蛋白质之一，约占髓鞘蛋白总量的1/3，位于髓鞘浆膜面。其与髓鞘膜带负电荷的磷脂相互作用后紧密黏附结合，具有维持髓鞘结构和功能稳定、神经传导绝缘和快速传导作用，并在OL髓鞘形成和分化成熟过程中扮演重要角色[8]。研究[9，10]表明，MBP在脑损伤、脱髓鞘疾病、缺血性脑血管病、神经退行性疾病及慢性神经性疼痛疾病中广泛存在,可作为CNS相关性损伤标志物。但癫痫发作后不同时期，脑组织中髓鞘相关蛋白的表达动态变化未见文献报道。MAG是首先被发现的抑制髓鞘生长的蛋白，位于直接和轴突相接触的髓鞘膜最里层,介导胶质细胞与轴突及外周神经系统的施万细胞的相互作用参与髓鞘的形成，维持正常髓鞘化的神经纤维稳态、存活及降解，从而使脑内点对点神经冲动稳定快速的传导[11]。MAG也是髓鞘来源的神经生长抑制因子的主要成分。在神经系统发育的不同阶段，MAG显示不同的功能，发育期促进轴突生长，成熟期抑制轴突生长[12]。MBP mRNA主要是转运MBP蛋白与其相应受体结合信号，介导细胞质膜与轴突建立联系，参与髓鞘形成过程[13]。MAG mRNA编码MAG蛋白，MAG mRNA是髓鞘形成过程中最早出现的髓鞘特异性基因[14]，这些丰富的蛋白质参与了轴突与神经胶质细胞相互连接和髓鞘形成，促进神经再生。

我们的前期研究[15]表明，癫痫患者致癫痫灶组织内MBP阳性纤维明显减少，反映成熟的OL功能障碍，但研究仅限于一个时期内髓鞘蛋白的表达情况。癫痫海马组织病变表现为CA1区神经细胞层次变少，数量减少，排列紊乱、稀疏，部分神经细胞核深染、固缩，呈杆状或三角形，核仁不明显，细胞周围间隙增大，上述表现在病程越长及发作更严重程度时更为明显。本研究增加了对急性惊厥发作期及慢性惊厥发作期这两个时段癫痫发作时海马组织变化观察，旨在进一步阐述癫痫发作病程中髓鞘蛋白表达的动态变化过程，最终找到与癫痫发作机制及髓鞘损害程度相适应的标志物。本研究结果显示，与正常组比较，各组MBP、MAG mRNA及蛋白表达均降低，说明癫痫的发病可使髓鞘相关蛋白基因明显减少，从而抑制MBP、MAG蛋白的合成，进一步支持癫痫的发生的确与髓鞘脱失有关。实验组与假手术组相比也出现上述变化趋势，说明仅安装电极不会引发癫痫发作，而刺激可以诱发及加重癫痫发作频率。文献[16]报道，癫痫患者及癫痫大鼠模型脑组织中MBP mRNA表达均明显降低；而另一研究[17]则显示在癫痫大鼠中MAG蛋白表达降低，MAG mRNA及MBP蛋白没有明显变化。本研究结果与其不一致，其原因可能与癫痫发作病程及病情严重程度不一致有关，且MBP贯穿于OL发育成熟的全过程，而MAG主要在成熟阶段表达。实验1组与实验2组比较也有上述表达降低的现象出现，表明髓鞘损伤贯穿于癫痫发生的整个过程；且当病程迁延时，脱髓鞘程度愈发严重。但两者在癫痫发作过程中髓鞘蛋白表达的调控机制，OL分化异常及相关基因的差异性表达在癫痫中的具体作用机制还需要进一步研究证实。

综上所述，癫痫发作大鼠脑海马组织内可出现明显脱髓鞘反应，即表现为OL产生的MBP及MAG蛋白表达下调，且病程越长，脱髓鞘反应越严重。这可能是脑内导致神经纤维过度异常放电的原因之一，从而加重癫痫的发作。

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