黑果枸杞原花青素对小鼠衰老皮肤抗氧化作用及凋亡相关蛋白的影响

罗文娟，冶娟，马文宇，郭砚，陶丛敏

(青海大学附属医院，西宁810001)

黑果枸杞为茄科枸杞属，为传统名贵药材，主要长于我国柴达木盆地一带和欧洲中亚地带，具有降血脂、免疫调节、抗氧化、抗衰老、治疗心血管疾病、预防动脉硬化、防治阿尔茨海默病等功能[1]。黑果枸杞中含有的原花青素(PC)是一种低聚体花青素，水溶性强，易吸收[2]，在食品开发、医学美容及临床药用等方面都有着广阔的应用前景。2016年11月～2017年9月，我们以紫外线(UV)照射联合皮下注射D-半乳糖，通过内源性生理因素和外源性环境因素共同作用建立老化动物模型模拟皮肤的自然衰老，观察柴达木黑果枸杞PC在皮肤衰老模型中抗氧化、抗衰老的机制，为黑果枸杞的临床应用提供理论依据。

1　材料与方法

1.1　材料

健康昆明种雌性小鼠50只，45日龄，体质量18～22 g，购于西安交通大学实验动物中心。适应性饲养5 d，其间自由摄食饮水，室温控制在(20±5)℃。柴达木黑果枸杞PC粉末(西安瑞林生物)；水溶性维生素E粉末、D-半乳糖(北京索莱宝生物)。超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、丙二醛(MDA)、羟脯氨酸(Hyp)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)；小鼠半胱氨酸蛋白酶(caspase)-3、caspase-9酶联免疫吸附测试盒(武汉伊莱瑞特生物公司)。infinite M200PRO酶标仪(TECAN公司)。X-Mark型BIO-RAD酶标仪(BIO-RAD公司)，DU800分光光度计(BECKMAN COULTER公司)，W201B水浴锅(金坛市岸头科辉仪器厂)，BB150 CO2培养箱(美国Thermo公司)，SIGMA 3K15离心机(SIGMA公司)，长波紫外线(UVA，峰波长值为340 nm)灯管、中波紫外线(UVB，峰波长值为313 nm)灯管(南京卡知电子科技有限公司)，UV辐照仪(北京精密仪器有限公司)。

1.2　动物分组与模型建立

将小鼠随机分为正常对照组、模型对照组、维生素E组、PC低剂量组、PC高剂量组各10只。剪去小鼠颈背部长毛，用双蒸水配置4%的硫化钠溶液，均匀涂抹在颈背部，范围约2 cm×3 cm;6～8 min后待毛发变为淡黄色并略透明后，纱布轻轻拭去，温水冲洗。正常对照组小鼠正常光照饲养。模型对照组、维生素E组、PC低剂量组、PC高剂量组参照文献[3]方法制备皮肤衰老模型。每日颈背部皮下注射5% D-半乳糖10 mL/kg，同时隔日进行UV照射，UVA、UVB灯管各1支，平行排列，间距约5 cm，每次照射前灯管预热15 min，光源距鼠约40 cm垂直高处，照射时间为40 min/次，隔日照射1次，持续40 d(UVA累计辐照剂量为98.4 J，UVB累计辐照剂量为78.4 J)。

1.3　干预方法

从开始注射D-半乳糖后第11天起，PC低剂量组、PC高剂量组分别给予50、100 mg/(kg·d)PC溶液灌胃，正常对照组、模型对照组给予等体积生理盐水灌胃，维生素E组给予等体积维生素E溶液灌胃，连续灌胃30 d。

1.4　皮肤含水量检测

实验第41天，断髓处死小鼠，快速取背部照光及注射处皮肤组织，去除皮下脂肪及其他结缔组织，预冷生理盐水漂洗，滤纸拭干，-80 ℃保存。取0.5 cm×0.5 cm大小皮肤，滤纸拭干，精确称取湿重，随即放入80 ℃烘箱中烘干12 h，精密称取干重，以(湿重-干重)/湿重×100%计算皮肤含水量。

1.5　皮肤组织上清液中SOD、GSH-PX活力和MDA、Hyp水平检测

取背部衰老皮肤0.5 g，置入研钵中，加少许液氮研磨，移至试管中;加入预冷生理盐水4.5 mL，用组织匀浆器在冰水浴中匀浆5～8 min，制成10%组织匀浆。以3 500 r/min离心15 min，取上清液;采用酶生化法检测SOD、GSH-PX活力和MDA、Hyp水平，严格按照试剂盒说明书操作。

1.6　皮肤组织上清液中caspase-9、caspase-3水平检测

取背部皮肤组织匀浆离心所得上清液，采用双抗体夹心ELISA法检测caspase-3、caspase-9水平，严格按照试剂盒说明书操作。

1.7　统计学方法

2　结果

2.1　四组皮肤外观及行为学特征比较

D-半乳糖注射联合UV辐照1周后，模型对照组小鼠毛色灰暗无光，行动逐渐迟缓、精神淡漠，出现畏光、抱团、饮食饮水量减少等现象;颈背部皮肤出现皮革样改变、皱纹加深、脱屑，出现红斑、色沉，脊柱逐渐变硬并隆起;造模40 d时，以上现象更明显。与模型对照组比较，维生素E组、PC低剂量组、PC高剂量组上述症状明显减轻。正常对照组小鼠毛色光滑鲜亮，皮肤弹性正常，行动敏捷，正常饮食摄水。

2.2　四组皮肤含水量比较

正常对照组、模型对照组、维生素E组、PC低剂量组、PC高剂量组皮肤含水量分别为63.34%±4.35%、42.63%±2.36%、48.41%±3.04%、55.30%±2.56%、61.60%±2.48%。模型对照组皮肤含水量低于正常对照组(P<0.05)，维生素E组及PC低、高剂量组皮肤含水量较模型对照组升高(P均<0.05)，PC低、高剂量组较维生素E组升高(P均<0.05)。

2.3　四组皮肤组织上清液中SOD、GSH-PX活力和MDA、Hyp水平比较

模型对照组SOD、GSH-PX活力和Hyp水平较正常对照组降低，MDA水平升高(P均<0.05)；与模型对照组比较，维生素E组及PC低、高剂量组皮肤组织上清液中SOD、GSH-PX活力和Hyp水平升高，MDA水平降低(P均<0.05)；PC低、高剂量组SOD活力和Hyp水平较维生素E组升高，MDA水平较维生素E组降低(P均<0.05)。见表1。

表1　四组皮肤组织上清液中SOD、GSH-PX活力和MDA、Hyp水平比较

注：与正常对照组比较，*P<0.05；与模型对照组比较，#P<0.05；与维生素E组比较，△P<0.05。

2.4　四组皮肤组织上清液中caspase-9、caspase-3水平比较

模型对照组caspase-9、caspase-3水平较正常对照组升高(P均<0.05)；维生素E组及PC低、高剂量组较模型对照组降低(P均<0.05)；PC低、高剂量组较维生素E组降低(P均<0.05)。见表2。

表2　　　　四组皮肤组织上清液中caspase-9、caspase-3水平比较

注：与正常对照组比较，*P<0.05；与模型对照组比较，#P<0.05；与维生素E组比较，△P<0.05。

3　讨论

皮肤老化是一个复杂的生物学过程，按来源可分为内源性老化和外源性老化两部分[4]。内源性老化受个体遗传信息的控制，是不可阻止、只能延缓的不可逆老化；外源性老化是皮肤受外界多种因素(UV、风吹日晒、雾霾、吸烟等)影响，其中最主要的因素是UV辐射，因此外源性老化又称为光老化，光老化是可以预防的。UV按波长不同可分为UVA、UVB、短波UV(UVC)，到达皮肤表皮，引起皮肤衰老的主要是UVA和UVB，其中UVA可穿透皮肤全层。D-半乳糖可打乱细胞的正常代谢水平，使自由基蓄积，导致全身性的衰老[5]。本研究结果显示，实验1周后小鼠毛色灰暗，行动迟缓，出现畏光、抱团、饮食饮水量减少现象，精神衰退；暴露部位皮肤出现皮革样改变、皱纹加深、脱屑，出现红斑甚至糜烂，脊柱逐渐变硬并隆起。这表明皮下注射D-半乳糖联合紫外线UVA+UVB辐照可引起皮肤老化。

黑果枸杞为茄科枸杞属类植物，多棘刺灌木，主要分布在高山、沼泽、沙漠地带，是一种独特的药食两用植物。黑果枸杞具有多种营养成分，除含有人体必需的18种氨基酸外还包括各种氨基酸、多糖、脂肪酸、甜菜碱、维生素、多种微量元素等，营养及药用价值很高[6]。其中所包含的PC是高效的天然抗氧化剂，能有效清除机体内的自由基[7]。PC具有强大的生理功能，包括抗氧化、预防及治疗心脑血管疾病、抗肿瘤、抗病毒、防治眼部疾病等多种功能。

自由基学说认为，细胞代谢过程中产生的自由基是造成机体衰老的主要原因之一[8]，其中大多是氧自由基(ROS)。正常机体可通过体内的酶和非酶两种不同的防御系统清除体内蓄积的自由基[9]，使氧化应激维持平衡状态。酶防御系统指SOD、GSH-PX等这些体内活性物质，通过酶的水解反应清除自由基，其含量及活性可反映机体抗氧化能力。年龄的增长及外源性因素的破坏使得氧化与抗氧化能力失衡，引起机体的氧化损伤，导致ROS蓄积。而MDA是ROS攻击细胞膜发生脂质过氧化的最终降解产物，使细胞内的蛋白质发生交联、降解，破坏细胞结构，间接反映机体老化[10，11]。胶原蛋白是真皮的重要成分，可维持皮肤的水分和弹性。Hyp是胶原蛋白主要成分[12]，在胶原蛋白中占13.4%，是构成胶原蛋白的主要骨架。随着年龄的增长及自由基的蓄积，Hyp发生交联、降解，使胶原蛋白断裂，皮肤失去弹性、干燥，产生皱纹。皮肤衰老过程中水合能力下降，含水量减少，导致皮肤萎缩变薄，产生细纹。因此，皮肤组织中的SOD、GSH-PX、MDA、Hyp水平及皮肤含水量均可作为反映皮肤衰老的指标。本研究结果显示，UV照射联合皮下注射D-半乳糖可使皮肤的含水量明显下降、皮肤组织上清中SOD、GSH-PX活力和Hyp水平降低，MDA水平升高，说明UV和D-半乳糖可破坏机体的酶防御系统，导致MDA等物质的蓄积，造成机体损伤，降低皮肤组织Hyp水平及皮肤含水量，加速皮肤的老化；给予PC、维生素E灌胃后皮肤的含水量、组织上清中SOD、GSH-PX活力和Hyp水平、含水量升高，MDA水平降低；且PC低、高剂量组较维生素E组效果更明显。说明PC及维生素E均可保护小鼠机体的酶防御系统，提高机体的抗氧化应激能力，减轻小鼠皮肤的氧化损伤，且PC的抗氧化效果高于维生素E。

细胞凋亡因子与皮肤衰老也有着密切的关系，氧化应激反应蓄积的过量ROS会破坏细胞线粒体，使细胞释放更多的细胞色素C，进而活化caspase家族[13]。活化的上游凋亡始动因子caspase-9可激活下游的凋亡效应因子caspase-3，导致细胞凋亡;caspase-3能够在下游产生级联放大效应[14]，同时进一步促进上游caspase-9活化，加速细胞凋亡。caspase-3的激活标志着凋亡进入不可逆的过程。相关实验研究发现，一定量的UV辐照能活化caspase家族中的caspase-9、caspase-3，打开线粒体凋亡通路，引发细胞凋亡[15,16]。本研究中，模型对照组caspase-9、caspase-3水平较正常对照组升高，表明UV和D-半乳糖可上调caspase-9、caspase-3表达，引起细胞凋亡，加快皮肤的老化进程；给予PC、维生素E灌胃后，caspase-9、caspase-3水平降低，PC低、高剂量组较维生素E组效果更明显。这说明黑果枸杞PC与维生素E均能下调caspase-9、caspase-3水平，进而阻止细胞凋亡的发生，且黑果枸杞PC抑制凋亡的效果高于维生素E，这可能与PC中的酚羟基降低ROS含量，熄灭caspase上游信号有关[17]。

综上所述，黑果枸杞PC可增加皮肤的含水量，对抗UV联合D-半乳糖对小鼠皮肤的氧化应激反应，减少机体活性氧物质的蓄积，同时熄灭caspase上游信号，下调caspase-9的表达，进一步下调caspase-3的表达，阻止细胞凋亡的发展，减轻细胞凋亡，减缓皮肤衰老。本实验为黑果枸杞PC抑制UV联合D-半乳糖所致氧化损伤及细胞凋亡提供理论依据，为黑果枸杞的开发和应用提供新的市场及药用价值。

参考文献：

[1] 武睿,贺莉萍,石建业,等.黑果枸杞的保健作用研究进展[J].现代农业,2016(9):73-78.

[2] 张慧文,张玉,马超美.原花青素的研究进展[J].食品科学,2015,36(5):296-304.

[3] Sumiyoshi M, Hayashi T, Kimura Y. Effects of the nonsugar fraction of brown sugar on chronic ultraviolet B irradiation-induced photoaging in melanin-possessing hairless mice[J]. J Nat Med, 2009,63(2):130-136.

[4] Fisher GJ, Kang S, Varani J, et al. Mechanisms of photoaging and chronological skin aging[J]. Arc Dermatol, 2002,138(11):1462-1470.

[5] 王红丽,吴铁,吴志华,等.小鼠亚急性皮肤衰老模型的建立[J].中国药学杂志,2003(10):35-37.

[6] 楼舒婷. 黑果枸杞的活性成分和挥发性组分研究[D].杭州：浙江大学,2015.

[7] Bagchi D， Bagchi M， Stohs SJ, et al. Free radicals and grape seed proanthocyanidin extract: importance in human health and diseaseprevention[J]．Toxicology， 2000,148(2-3):187-197.

[8] Lee HC, Wei YH. Mitochondrial alterations, cellular response to oxidative stress and defective degradation of proteins in aging[J].Biogerontology, 2001,2(4):231-244.

[9] 原慧萍,杨泽.氧化应激与衰老研究进展[J].中国老年保健医学,2015,13(5):14-17.

[10] Wang HT, Choi B, Tang MS. Melanocytes are deficient in repair of oxidative DNA damage and UV-induced photoproducts[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2010,107(27):12180-12185.

[11] 陈晓昱,马文宇.沙棘水提物对UVC辐射HaCaT细胞损伤的保护作用及其机制[J].山东医药,2017,57(13):42-44.

[12] 吕燕红.枸杞叶总黄酮对UVB照射致无毛小鼠皮肤光损伤的防护作用研究[D].兰州:兰州大学,2016.

[13] Rajendran P, Nandakumar N, Rengarajan T, et al. Antioxidants and human diseases[J]. Clin Chim Acta, 2014,436:332-347.

[14] Saleh A, Srinivasula SM, Acharya S, et al. Cytochrome c and dATP-mediated oligomerization of Apaf-1 is a prerequisite for procaspase-9 activation[J]. J Biol Chem, 1999,274(25):17941-17945.

[15] Boersma PM, Haarsma LD, Schotanus MP, et al. TNF-R1 and FADD mediate UVB-Induced activation of K+, channels in corneal epithelial cells[J]. Exp Eye Res, 2017,154:1-9.

[16] 加杨娥,任立汆,燕华玲.黑枸杞水提物对中波紫外线辐射后人角质形成细胞增殖与凋亡及凋亡相关蛋白表达水平的影响研究[J].中国全科医学,2017,20(27):3400-3404.

[17] 段雅彬,姚星辰,王财,等.黑果枸杞对X射线辐射小鼠的保护作用研究[J].天然产物研究与开发,2015,27(1):148-152.