IL-17A对人永生化角质形成细胞角蛋白17表达及STAT3信号通路的影响

卢永申，魏明

(郑州大学第五附属医院，郑州450052)

银屑病是一种由T细胞介导的持续存在的慢性、炎症性疾病，其主要表现是角质形成细胞(KC)的异常分化和增殖[1,2]。Th17细胞是新型的CD4+T细胞，其标志性细胞因子白细胞介素-17A(IL-17A)具有强大的致炎性，在银屑病的发生发展过程中发挥重要作用[3,4]。角蛋白也是上皮组织增生分化状态的分子标志，不同类型的上皮组织或同一类型的上皮组织处于增生分化的不同阶段，或经历异常的增生分化时，角蛋白的表达模式有显著差异。其中，角蛋白17(K17)是表皮细胞增生分化的重要标志分子。大量研究表明，银屑病的发病机制与K17在T淋巴细胞介导下的免疫反应密切相关[5～7]。信号转导和转录激活因子(STAT)信号通路是细胞因子发挥其生物效应最普遍且最重要的细胞内信号传导通路，其中STAT3广泛表达于不同的细胞和组织。活化的STAT3与启动子结合，启动下游靶基因的表达，从而影响细胞周期或抑制细胞凋亡而参与病变的发生发展。已有研究表明，STAT3的活化与银屑病角质形成细胞的异常增生有关。2016年5月，我们通过体外培养人永生化角质形成细胞HaCaT，观察IL-17A对细胞K17及STAT3信号通路的影响，为探讨银屑病的发病机制和靶向治疗提供理论依据。

1　材料与方法

1.1　材料

HaCaT购于南京凯基生物有限公司，TRIzol购于美国Invitrogen公司，重组IL-17A购于美国PeproTech公司，改良Eagle培养基(DMEM)、胎牛血清、0.25%胰酶/EDTA、青霉素/链霉素双抗溶液、二甲基亚砜(DMSO)、RPMI1640培养液购于美国Gibco公司；5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐(BCIP)/四唑硝基蓝(NBT)显色试剂盒购于瑞士Roche公司，四甲基偶氮唑盐(MTT)试剂盒购于美国Sigma公司，逆转录PCR试剂盒购于大连宝生物工程有限公司，异硫氰酸荧光素(FITC)标记的Annexin Ⅴ细胞凋亡试剂购于美国BD公司，流式细胞仪检测相关试剂购于美国BD公司，细胞培养箱为美国Thermo公司产品。

1.2　细胞培养

向细胞中加入含10%胎牛血清及1%青链霉素的改良Eagle培养基(DMEM)，37 ℃、5% CO2条件下培养。待细胞单层铺满培养瓶后，PBS漂洗1次，加入0.25%胰蛋白酶消化液，待镜下细胞回缩变圆时，加入DMEM培养液终止消化。收集细胞，离心弃上清，将细胞悬液分别移至冷冻管中，每管1.5 mL。将冻存管先置于4 ℃冰箱2 h，再移至-80 ℃低温冰箱24 h，然后投入-196 ℃液氮中保存备用。

1.3　细胞分组与处理

将细胞重悬于细胞培养液中，按5×105/mL接种于6孔板，加入含10%胎牛血清的RPMI1640培养液培养24 h。待细胞达到70%～80%融合度时，将细胞分为三组。空白对照组仅加DMEM高糖培养基，诱导组加入含50 μg/L IL-17A的DMEM高糖培养基，抑制剂组加入含50 μg/L IL-17A的DMEM高糖培养基和10 μmol/L STAT3抑制剂Piceatannol。孵育6 h后，置换为含10%胎牛血清的RPMI1640培养液，根据实验要求继续培养。

1.4　细胞增殖能力观察

采用MTT比色法。细胞分组培养12、24、36、48 h时，分别检测细胞增殖情况。加入胰酶消化细胞制备单细胞悬液，按6×104/孔接种于96孔培养板，细胞融合达到80%左右时开始检测。弃原培养基，每孔加入5 mg/mL MTT 20 μL，37 ℃孵育4 h。弃上清，每孔加入150 μL DMSO，震荡10 min充分溶解蓝色结晶，于490 nm波长处检测吸光度A值。

1.5　细胞凋亡检测

采用流式细胞术。细胞分组培养48 h后，加入不含EDTA的胰蛋白酶消化，PBS洗涤，离心弃上清，加入缓冲液100 μL重悬细胞，随后加入Annexin Ⅴ-FITC 5 μL和溴化乙锭(PI)5 μL，室温避光孵育15 min。加入500 μL缓冲液，流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.6　细胞K17 mRNA表达检测

采用RT-PCR方法。提取培养48 h后的各组细胞总RNA，逆转录合成cDNA。目的基因K17上游引物5′-ATGGATCCATGACCATGCAGGCCTTGGAGA-3′，下游引物5′-AGGAATTCTCACGTCTTCACATCCAGCAGGA-3′；β-actin上游引物5′-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3′，下游引物5′-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3′。PCR反应体系为25 μL，扩增条件为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，共35个循环；最后72 ℃延伸5 min。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统扫描拍照，计算各电泳条带灰度值与β-actin条带灰度值的比值，即为目的基因的相对表达量。

1.7　细胞K17、p-STAT3蛋白表达检测

采用Western blotting法。收集培养48 h后的各组细胞，提取总蛋白，BCA法检测蛋白浓度。上样40 μg，电泳、转膜及封闭；一抗孵育(兔抗人K17、p-STAT3多克隆抗体滴度为1∶1 000，鼠抗人β-actin单克隆抗体为1∶1 000)4 ℃过夜，二抗孵育(山羊抗兔IgG抗体滴度为1∶2 000，马抗小鼠IgG抗体为1∶2 000)2 h；BCIP/NBT显色液显色，凝胶成像系统观察结果。以目的蛋白条带与相应内参β-actin条带的灰度值比值作为其蛋白水平的相对表达量。

1.8　统计学方法

2　结果

2.1　各组细胞增殖能力比较

见表1。随着培养时间的延长，各组细胞增殖能力均增加，作用36、48 h时高于作用12、24 h时(P均<0.01)。诱导组各时间点HaCaT细胞增殖能力均较空白对照组、抑制剂组升高(P均<0.01)，空白对照组与抑制剂组比较差异无统计学意义(P均>0.05)。

表1　各组细胞增殖能力比较

注：与空白对照组比较，*P<0.01；与抑制剂组比较，#P<0.01；与同组作用12、24 h比较，△P<0.01。

2.2　各组细胞凋亡率比较

空白对照组、诱导组、抑制剂组的细胞凋亡率分别为15.34%±1.32%、5.96%±0.68%、15.62%±1.26%，诱导组细胞凋亡率较空白对照组和抑制剂组降低(P均<0.05)，空白对照组与抑制剂组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3　各组K17 mRNA表达比较

空白对照组、诱导组、抑制剂组K17 mRNA的相对表达量分别为0.16±0.08、0.31±0.12、0.14±0.09，诱导组K17 mRNA表达高于空白对照组和抑制剂组(P均<0.05)，空白对照组与抑制剂组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4　各组K17、p-STAT3蛋白表达比较

空白对照组、诱导组和抑制剂组K17蛋白相对表达量分别为0.49±0.23、0.98±0.31、0.46±0.25，p-STAT3蛋白相对表达量分别为0.71±0.28、1.42±0.39、0.68±0.31，诱导组K17、p-STAT3蛋白表达水平均高于空白对照组和抑制剂组(P均<0.05)，空白对照组与抑制剂组比较差异无统计学意义(P均>0.05)。

3　讨论

角蛋白是角质细胞中的主要骨架蛋白，多于上皮细胞中表达，是上皮细胞生长、分化及成熟的重要标志物[8]。研究表明，在银屑病患者皮损中，KC所表达的角蛋白谱会发生改变，K17水平显著升高。K17作为银屑病增殖相关角蛋白，在正常皮肤中不表达或表达量很低，而在银屑病患者的皮损中呈高表达，同时其表达水平与银屑病发病过程和严重程度有一定相关性[9，10]。所以，K17与银屑病的关系非常密切，在银屑病的发生发展中具有重要作用。

文献[11]报道，来源于Th17、Th22细胞的IL-17A和IL-22在角质形成细胞以剂量相关性方式上调K17 mRNA及蛋白表达，这些效应被STAT-1和STAT-3特异抑制剂小干扰RNA部分阻断。该报道还提出存在K17-T细胞-细胞因子免疫环，其中异位表达K17通过激活自身反应性T细胞影响银屑病[12]。应用反义寡核苷酸和RNA干扰抑制K17 mRNA和蛋白在银屑病皮肤组织中的表达，在临床和组织学上对银屑病均有改善作用[12]。也有研究表明，K17携带某些和链球菌M6蛋白相似的表位[13]，这些表位可以激活T细胞(如Th1细胞)增殖。活化的T细胞产生银屑病相关细胞因子γ干扰素(IFN-γ)，细胞因子IFN-γ又可以依赖STAT1和STAT3信号通路激活KC表达K17，继而形成一个反应环路，再次激活T细胞增殖和银屑病相关细胞因子的产生[14]。

Th17细胞在银屑病的形成中发挥关键作用[15]，其分泌的IL-17A通过多种途径影响角蛋白细胞[16]。有关IL-17A激活KC中STAT3信号通路未见文献报道，为此我们对IL-17A调控KC中K17表达的具体机制进行探讨。我们预先用STAT3信号通路抑制剂Piceatannol处理KC，再用IL-17A进行刺激，发现与诱导组比较，抑制剂组K17 mRNA和蛋白表达均下降，表明IL-17A调控K17的表达可能是通过激活JAK-STAT3这条信号转导通路实现的。这个结果与STAT3在银屑病患者皮损KC中特异性高表达是一致的[17]。其调控机制是IL-17A通过与KC表面受体结合后激活STAT3来上调K17的表达。IL-17A可在角蛋白水平上参与促进银屑病的发生发展，进一步肯定了Th细胞及其细胞因子在银屑病中的作用，为银屑病的发病机制研究和将来对细胞因子、信号通路的抗银屑病临床治疗提供了新的靶点和思路。

综上所述，K17在T细胞免疫调节下，通过STAT3信号通路调节细胞增殖和凋亡，活化相关生长因子，在促进银屑病发生发展过程中具有重要作用。

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