HPLC波长切换法同时测定仙方活命片中6个成分的含量

刘源，丁广军，陈慧慧

(商丘市第一人民医院 药学部，河南　商丘　476100)

仙方活命片处方源于《卫生部颁药品标准》中药成方制剂第十七册[1]，由金银花、防风、赤芍等13味中药材加工而成，临床上主要用于火毒壅盛、痈疽疮疡、红肿热痛、脓成不溃等症状的治疗。方中金银花为忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThunb.的干燥花蕾或带初开的花，性味甘寒，最善清热解毒疗疮，故重用为君药；配以赤芍、当归尾、乳香、没药、陈皮行气活血通络、消肿止痛，共为臣药；佐以防风、白芷通滞散结，浙贝母、天花粉清热化痰，结皂角刺、穿山甲通行经络、透脓溃坚；甘草清热解毒、调和诸药。诸药合用，共奏清热解毒、散瘀消肿、化脓生肌之功[2]。

仙方活命片现行质量标准仅有理化鉴别项，在质量控制中尚显不足，也未检索到对该制剂定量测定的文献报道，方中君药金银花含有有机酸、黄酮、皂苷及鞣质等化学成分，其中有机酸主要为绿原酸、异绿原酸和咖啡酸等，黄酮类主要为木犀草素、忍冬苷和木犀草苷等，《中华人民共和国药典》2015年版一部以绿原酸、木犀草苷为其质量控制的指标；方中臣药赤芍含有单萜类、酚类、黄酮类、鞣质类等成分，其中单萜类主要为芍药苷、芍药内酯苷等，《中华人民共和国药典》2015年版一部以芍药苷为其质量控制的指标；方中佐药防风含有挥发油、色原酮类、有机酸、香豆素类等成分，《中华人民共和国药典》2015年版一部以升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷为其质量控制的指标。本研究采用HPLC波长切换法，对仙方活命片方中金银花所含绿原酸、木犀草素、木犀草苷，赤芍所含芍药苷，防风所含升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷进行同时测定研究，检测方法简便、快速、灵敏、准确，适用于仙方活命片质量控制分析，对进一步提高仙方活命片质量标准提供了数据支持。

1　仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260型全自动高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；BS224S型电子分析天平(十万分之一，德国赛多利斯公司)；ASS150型超声波提取器(济宁科特超声电子有限责任公司)。

1.2 试药

仙方活命片(规格：每片重0.35 g)来源于广东万年青制药有限公司；绿原酸对照品、木犀草苷对照品、木犀草素对照品、芍药苷对照品、升麻素苷对照品、5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号分别为110753-201716、111720-201609、111520-201605、110736-201640、111522-201712、111523-201610)；甲醇、乙腈为色谱纯；其他试剂均为分析纯。

2　方法

2.1 色谱条件

采用Agilent SB C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱；流动相A：乙腈-甲醇(1∶1)，流动相B：0.4%磷酸溶液，梯度洗脱[3-4](0～10 min，15.0%A；10～24 min，15.0%A→32.0%A；24～31 min，32.0%A→38.0%A；31～39 min，38.0%A→50.0%A；39～45 min，50.0%A→15.0%A)；0～16 min时在326 nm[5]波长下检测绿原酸，16～24 min在350 nm[5-7]波长下检测木犀草苷和木犀草素，24～31 min时在230 nm[6，8-9]波长下检测芍药苷，31～45 min在254 nm[6，10-11]波长下检测升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷；流速：0.8 mL·min-1；柱温：30 ℃；进样量为10 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备分别精密称取对照品绿原酸、木犀草苷、木犀草素、芍药苷、升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷各适量，用甲醇分别制成单一成分对照品储备溶液(绿原酸2.164 g·L-1、木犀草苷0.572 g·L-1、木犀草素0.436 g·L-1、芍药苷1.494 g·L-1、升麻素苷1.532 g·L-1、5-O-甲基维斯阿米醇苷0.718 g·L-1)。再分别依次吸取各对照品储备溶液5.0、2.5、2.5、5.0、5.0、5.0 mL，置同一100 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备取仙方活命片，研细，取约1.0 g，精密称定，置50 mL量瓶中，加甲醇适量，超声提取30 min，放冷至室温，用甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得仙方活命片供试品溶液。

2.2.3 阴性样品溶液的制备按仙方活命片质量标准项下的处方和生产工艺，分别制备缺金银花阴性样品、缺防风阴性样品和缺赤芍阴性样品，按2.2.2所述的制备方法制成阴性样品溶液。

2.3 专属性试验

精密吸取2.2.1、2.2.3项下的溶液，按照2.1项下色谱条件进行检测。结果显示，在与对照品绿原酸、木犀草苷、木犀草素、芍药苷、升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷色谱图相应的保留时间处，供试品溶液色谱图中有相应的色谱峰，而阴性样品色谱图中未显示对应的色谱峰，阴性无干扰，专属性强，色谱图见图1。

2.4 线性关系考察

分别精密吸取2.2.1项下绿原酸、木犀草苷、木犀草素、芍药苷、升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品储备溶液各10.0 mL，用甲醇定容至100 mL，作为线性关系工作溶液Ⅰ，再用甲醇分别稀释2、4、8、16、20倍，依次制得线性关系工作溶液Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ。按照2.1项下色谱条件进行测定，采用质量浓度(mg·L-1)为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，进行线性回归，见表1。

注：A.对照品溶液；B.供试品溶液；C.金银花阴性样品溶液；D.赤芍阴性样品溶液；E.防风阴性样品溶液；1.绿原酸；2.木犀草苷；3.木犀草素4.芍药苷；5.升麻素苷；6.5-O-甲基维斯阿米醇苷。图1　对照品、供试品、金银花阴性样品、赤芍阴性样品和防风阴性样品HPLC图

表1　线性关系试验结果

2.5 精密度试验

取2.2.1项下的混合对照品溶液，按照2.1项下色谱条件测定，连续进样6次，测定峰面积，结果绿原酸、木犀草苷、木犀草素、芍药苷、升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷峰面积的RSD分别为0.63%、0.99%、1.13%、0.87%、1.02%和0.90%。

2.6 重复性试验

取同一批次仙方活命片样品6份，按照2.2.2的方法制备供试品溶液，再按照2.1项下色谱条件进样测定，分别计算绿原酸、木犀草苷、木犀草素、芍药苷、升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷的含量，并计算所测组分含量的RSD，结果所测组分的RSD依次为1.04%、0.37%、1.44%、0.79%、1.26%和1.51%。

2.7 稳定性考察

取同一仙方活命片供试品溶液，室温下放置0、2、4、8、12、16 h，按照2.1项下色谱条件进样测定，记录绿原酸、木犀草苷、木犀草素、芍药苷、升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷的峰面积值，结果仙方活命片供试品溶液室温下16 h内稳定，所测各成分峰面积的RSD分别为0.59%、1.17%、1.06%、0.74%、0.96%和1.01%。

2.8 加样回收率试验

称取已知含量的仙方活命片6份，每份约0.5 g，研细，精密称定，分别精密加入绿原酸对照品溶液(0.627 g·L-1)5.0 mL、木犀草苷对照品溶液(0.381 g·L-1)1.0 mL、木犀草素对照品溶液(0.306 g·L-1)1.0 mL、芍药苷对照品溶液(0.689 g·L-1)3.0 mL、升麻素苷对照品溶液(0.937 g·L-1)2.0 mL、5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品溶液(0.993 g·L-1)1.0 mL，甲醇适量，按照供试品溶液制备方法制备加样回收样品溶液。再按照2.1项下色谱条件及上述检测方法，计算这6个组分的回收率及RSD，结果见表2。

表2　绿原酸、木犀草苷、木犀草素、芍药苷、升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷的回收率(n=6)

2.9 样品含量测定

取3批仙方活命片，按照2.2.2的方法制备供试品溶液，再按照2.1项下色谱条件进样，测定绿原酸、木犀草苷、木犀草素、芍药苷、升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷含量，结果见表3。

表3　含量测定结果(n=3)　mg·g-1

3　讨论

3.1 检测波长的选择

取所测各成分绿原酸、木犀草苷、木犀草素、芍药苷、升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品储备溶液适量，在200～400 nm波长范围内进行紫外扫描，结果绿原酸在326 nm处有最大吸收，木犀草苷和木犀草素在350 nm处有最大吸收，芍药苷在230 nm处有最大吸收，升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷在254 nm处有最大吸收。同时参考《中国人民共和国药典》2015年版一部金银花、赤芍和防风项下各成分的检测波长，结合液相色谱图，最终确定采用波长切换法，0～16 min时在326 nm波长下检测绿原酸，16～24 min在350 nm波长下检测木犀草苷和木犀草素，24～31 min时在230 nm波长下检测芍药苷，31～45 min在254 nm波长下检测升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷。

3.2 样品制备方法的优化

在选择样品溶液制备方法时，本文分别对提取方法：超声提取、加热回流提取；提取溶剂：甲醇、70%甲醇、50%甲醇、水；提取时间：30、60、90 min进行了对比考察，以所测各成分绿原酸、木犀草苷、木犀草素、芍药苷、升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷的提取率和操作的便捷性为指标，优选最佳的样品制备方法为甲醇超声提取30 min。

4　总结

本研究建立了HPLC波长切换法同时测定仙方活命片中绿原酸、木犀草苷、木犀草素、芍药苷、升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷的方法。该方法溶液制备简便、快速、稳定性好；所建立的方法灵敏度高、准确性好，测定结果准确可靠、重复性好，对进一步提高仙方活命片质量标准提供了数据支持，确保了仙方活命片的产品质量和疗效的一致性。

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