皱皮木瓜总酚酸分离纯化工艺及生物活性研究△

肖敏，舒佳为，覃瑞，刘虹，杨光忠

(1.中南民族大学 生命科学学院，湖北　武汉　430074；2.大连民族大学 环境与资源学院，辽宁　大连　116600；3.中南民族大学 药学院，湖北　武汉　430074；4.中南民族大学 民族药学国家级实验教学示范中心，湖北　武汉　430074)

木瓜的正品皱皮木瓜Chaenomelesspeciosa(Sweet)Nakai为蔷薇科贴梗海棠的果实，植物资源丰富，其主要的化学成分包括鞣质类、黄酮类、皂苷类、有机酸、三萜等结构类型，具有抑菌、抗氧化、保肝和抗炎镇痛等药理活性，酚酸类为其主要的活性成分[1-3]。基于此，本文利用大孔树脂对酚酸类分离纯化工艺进行研究，富集总酚酸的含量达到50%以上，并对其抗氧化和抗糖尿病活性进行研究，旨在为后续开发该植物资源，创制新药打下基础[4-5]。

1　仪器与材料

1.1 仪器

可见分光光度计UV1800C(上海美谱达仪器有限公司)；旋转蒸发仪RE-200A(上海亚荣生化仪器厂)；电子分析天平CP224C(上海奥豪斯仪器有限公司)；循环水式多用真空泵SHB-111A(上海卫凯仪器设备有限公司)；台式恒温振荡器THZ-B(太仓市实验设备厂)；蠕动泵驱动器BT100-2J(保定兰格恒流泵有限公司)；Multiskan酶标仪(美国热电Thermo公司)；真空冷冻干燥机(丹麦Labogene公司)；玻璃层析柱2×30 cm。

1.2 材料

树脂D101、AB-8(上海摩速科学器材有限公司)；NKA-9、S-8、HPD750、D1400(郑州华溢科技新材料股份有限公司)；超纯水(自制)；福林酚、对照品没食子酸、DPPH(1，1-二苯基-2-苦基肼)、ABTS[2-2-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺]、α-葡萄糖苷酶、PNPG(对硝基苯基-α-吡喃葡萄糖苷)、阿卡波糖(上海源叶生物科技有限公司)；α-淀粉酶、starch azure(SIGMA)；甲醇、乙醇、乙酸、Na2CO3、铁氰化钾、三氯乙酸、FeCl3、K2S2O8、AR(国药集团化学试剂有限公司)；DMSO(Sigma-aldrich VETEC试剂)。

皱皮木瓜产地湖北长阳，经中南民族大学生命科学学院刘虹博士鉴定为Chaenomelesspeciosa(Sweet)Nakai。

2　方法与结果

2.1 大孔树脂纯化工艺

2.1.1 总酚酸含量的测定福林酚法[6-7]测定总酚酸含量，标准品没食子酸及待测物全波长扫描见图1。精密称取干燥至恒重的没食子酸对照品100 mg，置于100 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至刻度。量取没食子酸对照品溶液1、2、3、4、5 mL，分别置于100 mL容量瓶中，各加入甲醇定容至刻度，摇匀，分别取1 mL至比色管，加入5 mL体积分数为10%福林酚试剂，反应10 min后加入5 mL质量浓度为2%Na2CO3溶液摇匀，25 ℃条件下静置1 h后在760 nm处测定各标准溶液的吸光度，以没食子酸质量浓度(X))对其吸光度(Y)作曲线，得回归方程Y=0.013 2X-0.000 4，r=0.999 6，总酚含量测定的线性范围为0～50 μg·mL-1。待测样品按照此方法测定。

图1　全波长扫描

2.1.2 上样液的制备精确称取一定量皱皮木瓜原药材粉末，以体积分数60%乙醇溶液、1∶40料液比、90 ℃、回流提取5 h为条件，抽滤后弃药渣得到提取液，浓缩至恒重，超纯水溶解，冷冻后用真空冷冻干燥机干燥成粉末，备用。其中皱皮木瓜总酚酸浸膏得率为38.9%(浸膏得率=浸膏质量/原药材质量×100%)，总酚酸含量为30.3%(总酚酸含量=总酚酸质量/浸膏质量×100%)。

2.1.3 树脂的筛选将预处理的6种不同型号规格的大孔树脂烘干备用。分别称取上述各型号树脂约2 g，置于150 mL锥形瓶，向其中加入25 mL一定浓度总酚酸溶液，封口膜封口，置于恒温振荡器中，25 ℃、120 r·min-1，振荡24 h，达到吸附平衡后过滤，福林酚法测定滤液总酚酸浓度。将上述过滤的树脂水洗后吸干水分，加入25 mL 60%的乙醇溶液，封口膜封口，置于恒温振荡器，25 ℃、120 r·min-1，振荡24 h，充分解吸后过滤，福林酚法测定滤液总酚酸浓度，结果见表1。可见，D101大孔树脂对皱皮木瓜总酚酸的吸附和解吸能力都很强，最终选用D101。

吸附量=(m0-m1)/G

(1)

吸附率=(m0-m1)/m0

(2)

解吸率=m2/(m0-m1)

(3)

注：m0：吸附前酚酸质量(mg)；m1：吸附后酚酸质量(mg)；m2：解吸的酚酸质量(mg)；G：大孔树脂质量(g)。

表1　各大孔树脂的静态吸附和解吸性能

2.1.4 动态上样流速、浓度及体积考察取约5 g大孔树脂装柱，将浓度为1 mg·mL-1的总酚酸溶液分别以1、2、3、4、5 BV·h-1的流速进行树脂柱的上样，10 BV后停止上样，测定流出液的酚酸含量。结果见图2，可见随着上样流速的增加，吸附率逐渐下降，考虑到工艺成本和时间效率，确定最佳上样流速为2 BV·h-1。

图2　上样流速对D101大孔树脂吸附率的影响

取约5 g大孔树脂装柱，将上样浓度设置为0.5、1.0、1.5、2.0 mg·mL-1的总酚酸溶液以最佳流速上样(2 BV·h-1)，收集10 BV后，测定收集液的酚酸含量，结果见图3，可见随着上样浓度的增加，吸附率呈现一个先上升后下降的趋势，说明以D101的特性，不是浓度越大越好，而是在某个区域有很好的吸附能力，最终确定为上样浓度为1.0 mg·mL-1。

图3　上样浓度对D101大孔树脂吸附率的影响

取约5 g树脂装柱，以最佳浓度及流速上样40 BV，以1 BV为单位收集流出液，测定每个BV的酚酸浓度，结果见图4，可见随着收集液的逐渐流出，到第20个柱体积酚酸含量有明显的渗漏，说明此时达到了D101的饱和吸附量，再上样吸附效果会变差，超过载荷，最终确定上样体积为20 BV，即树脂的饱和吸附量为100 mg·g-1。

图4　泄露曲线

2.1.5 水洗流速及体积考察上样结束后，树脂表面以及层析柱内壁会附着一些水溶性多糖及皂苷等，此时需要用水将这些未被大孔树脂吸附的物质除去。

取约5 g树脂装柱，以浓度近似1.0 mg·mL-1，2 BV·h-1的流速上样10 BV，不同的水洗流速洗脱，以1 BV为单位收集流出液，合并相同流速收集的洗脱液，测定酚酸浓度，见图5。结果显示，随着洗脱流速增加，流出的酚酸量也随之增加，最后确定为2 BV·h-1进行超纯水洗脱。

图5　除杂用水流速的选择

取约5 g树脂装柱，以浓度近似1.0 mg·mL-1，2 BV·h-1的流速上样20 BV，2 BV·h-1水洗流速洗脱，以1 BV为单位收集流出液，以酚酸浓度为检测指标，测定每个BV的酚酸浓度，结果见图6，发现直至第5 BV酚酸泄漏量明显减少，确定进行超纯水洗脱的体积为4 BV。

图6　除杂用水量的选择

2.1.6 乙醇洗脱浓度、流速及体积考察由皱皮木瓜原药材提取工艺可见，60%的乙醇对总酚酸具有很好的溶解能力，待树脂吸附样品，超纯水除杂后，使用乙醇溶液进行解吸。

取约5 g树脂装柱，以浓度近似1.0 mg·mL-1，2 BV·h-1的流速上样10 BV，收集流出液1，用2 BV·h-1的流速的超纯水洗脱4 BV，收集洗脱液2，将乙醇浓度设置为20%、40%、60%、80%为上样洗脱浓度，流速为2 BV·h-1，结果见图7。可见当乙醇浓度为60%时洗出酚酸量最多，确定60%的乙醇进行洗脱。

图7　不同浓度乙醇洗脱对D101大孔树脂吸附的影响

取约5 g树脂装柱，以浓度近似1.0 mg·mL-1，2 BV·h-1的流速上样10 BV，收集流出液1，用2 BV·h-1的流速的超纯水洗脱4 BV，收集洗脱液2，用浓度为60%乙醇用不同流速上样，测定酚酸浓度，结果见图8，改变洗脱流速对开始酚酸流出浓度影响较小，然而随着流速的增大，洗脱率降低，最后确定最佳的洗脱流速为4 BV·h-1。

图8　洗脱剂的流速对D101大孔树脂吸附的影响

取约5 g树脂装柱，以浓度近似1.0 mg·mL-1，2 BV·h-1的流速上样20 BV，收集流出液1，用2 BV·h-1的流速的超纯水洗脱4 BV，收集洗脱液2，用浓度为60%乙醇4 BV·h-1流速洗脱，测定每个BV的酚酸浓度，结果见图9，随着洗脱体积的增加，酚酸含量逐渐减少至无，确定洗脱剂的体积4 BV。

图9　洗脱体积的考察

2.1.7 最佳纯化工艺验证取约5 g D101大孔树脂，装柱，浓度近似1.0 mg·mL-1的皱皮木瓜总酚酸溶液上样，上样流速2 BV·h-1，上样量20 BV，收集流出液1，超纯水除杂，洗脱流速2 BV·h-1，用量4 BV，收集流出液2，60%乙醇溶液解吸，洗脱流速4 BV·h-1，用量4 BV，收集流出液3，分别测定3次流出液的酚酸浓度，获得流出液3的质量。重复3次此实验，获得吸附率和洗脱率及纯化后皱皮木瓜总酚酸的含量。

结果见表2，纯化后总酚酸的含量由30.3%提高到71.1%，相比纯化前提高了2.3倍。

表2　D101大孔树脂纯化皱皮木瓜总酚酸验证试验

注：浸膏的回收率指纯化前后浸膏质量比。

2.2 纯化后待测样品的抗氧化活性初步研究

2.2.1 DPPH自由基清除率测定DPPH(1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical)是稳定的自由基，为清除自由基活性的检测提供了一个理想而又简单的模型。配制不同浓度的样品溶液，加入浓度为0.025 mg·mL-1的DPPH乙醇溶液2 mL，加入等体积的样品溶液，混匀，静置在37 ℃恒温箱20 min，于519 nm处测定溶液吸光度[5]。结果见图10～12，没食子酸IC50=(0.049±0.003)mg·mL-1，抗坏血酸IC50=(0.101±0.011)mg·mL-1，纯化后总酚酸IC50=(0.038±0.006)mg·mL-1。总酚酸清除DPPH自由基能力强于没食子酸和抗坏血酸。

图10　纯化后样品对DPPH·清除率的影响

图11　抗坏血酸对DPPH·清除率的影响

图12　没食子酸对DPPH·清除率的影响

2.2.2 ABTS+·自由基清除能力7.4 mmol·L-1的ABTS 0.2 mL与2.6 mmol·L-1的K2S2O80.2 mL混合均匀，在黑暗条件下，室温静置12～16 h，稀释一定倍数，让A734nm在0.7附近，作为ABTS+·工作液，取0.8 mL工作液与0.2 mL样品溶液，振摇10 s以充分混合，静置6 min后于734 nm处测定吸光度。结果见图13～15，纯化后的总酚酸IC50=(5.428±0.163)mg·L-1，没食子酸IC50=(1.929±0.07)mg·L-1，抗坏血酸IC50=(9.741±0.064)mg·L-1。总酚酸清除ABTS的能力强于抗坏血酸，但小于没食子酸。

图13　纯化后样品对ABTS+·清除率的影响

图14　抗坏血酸对ABTS+·清除率的影响

图15　没食子酸对ABTS+·清除率的影响

2.3 纯化后待测样品的抗糖尿病活性的初步研究[8]

2.3.1 ɑ-淀粉酶抑制活性测定ɑ-淀粉酶抑制剂是一种糖苷键水解酶抑制剂，临床上用于防治葡萄糖耐量缺损引起的餐后高血糖及早期糖尿病、高血脂、肥胖等症[8-9]。本实验探究纯化后样品是否具有α-淀粉酶抑制剂的功能。

取100 μL Tris-HCl-CaCl2缓冲液至EP管，加100 μL 50% DMSO溶解的样品溶液，加100 μL 6 μg·mL-1ɑ-淀粉酶溶液，37 ℃恒温箱静置，同时制备底物，100 mg溶解于10 mL Tris-HCl-CaCl2缓冲液，煮沸5 min后转移至恒温箱，37 ℃静置5 min，向EP管中加入200 μL底物(将煮沸过程中损失的水分补足至刻度)，37 ℃静置20 min后，加500 μL 50%乙酸停止反应，3000 r·min-1，4 ℃离心5 min，取上清液200 μL至96孔板，酶标仪测定吸光度。

I%=1-(A样品组-A样品对照组)/(A空白组-A空白对照组)×100%

(4)

结果见图16～17，阿卡波糖抑制α-淀粉酶活性的IC50值为(0.229±0.007)mg·mL-1，总酚酸的IC50值为(0.34±0.001)g·mL-1。其活性同阳性药物阿卡波糖相当。

图16　纯化后样品的ɑ-淀粉酶抑制活性曲线

图17　阿卡波糖的ɑ-淀粉酶抑制活性曲线

2.3.2 ɑ-葡萄糖苷酶抑制活性测定α-葡萄糖苷酶抑制剂的研究一直是抗糖尿病机制研究中很活跃的方面[10]。实验探究纯化后样品是否具有ɑ-葡萄糖苷酶抑制剂的功能。

取80 μL磷酸缓冲液于96孔板，加入4 U·mL-1酶液30 μL，15 μL DMSO溶解的样品，37 ℃反应5 min，加入3 mmol·L-1PNPG 30 μL于37 ℃静置15 min后于405 nm处测定吸光度。

I%=1-(A样品组-A样品对照组)/A空白组×100%

(5)

结果见图18～19，阿卡波糖抑制α-葡萄糖苷酶的活性IC50值为(0.426±0.262)g·mL-1，总酚酸IC50值为(0.071±0.024)mg·mL-1，说明总酚酸具有一定的α-葡萄糖苷酶抑制活性。

图18　纯化后样品的α-葡萄糖苷酶抑制活性曲线

图19　阿卡波糖的α-葡萄糖苷酶抑制活性曲线

2.4 数据处理

使用Origin 8.5、Prism 6.01、SPSS对数据进行图表制作及分析。

3　讨论

本实验通过对皱皮木瓜原药材进行粉碎，乙醇回流加热提取，获得初提物。测定总酚酸含量后，将初提物以水溶解，通过初提液上样吸附→水洗除杂→乙醇洗脱的步骤，得到纯化后的总酚酸，同初提物相比含量提高2.3倍，且工艺稳定可靠。纯化后的总酚酸具有很好的清除DPPH、ABTS+的能力，且与阳性对照药物阿卡波糖相比，总酚酸具有一定的抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性。从相关文献的报道的氧化应激与糖尿病及并发症的关系可以推测，本课题经过纯化的总酚酸在抗糖尿病领域具有潜在的应用前景[11-12]。本课题的研究不仅为皱皮木瓜种质资源的开发利用提供了参考，同时也为后续提升皱皮木瓜产品附加值提供了理论基础。

[1]王云亮，张芬，张华.药用木瓜综合开发利用[J].河北农业科学，2010，14(6)：120-122.

[2]刘世尧，白世川，李加纳.皱皮木瓜与光皮木瓜药材品质多性状指标综合评价研究[J].中国中药杂志，2012，38(5)：426-430.

[3]刘世尧.不同产区皱皮木瓜有机酸组成及主要成分分离纯化研究[D].重庆：西南大学，2012.

[4]吴立军.实用天然有机化学[M].北京：人民卫生出版社，2007.

[5]付蒙.人面果抗氧化与抗糖尿病活性的初步研究[D].武汉：中南民族大学，2012.

[6]王国军，唐辉，张淑兰.大孔树脂纯化核桃隔膜总黄酮的工艺研究[J].中草药，2013，44(19)：2688-2692.

[7]文冰杰，夏厚林，李瑞煜.UV法测定叠鞘石斛中总酚含量方法研究[J].辽宁中医药大学学报，2016，18(1)：44-46.

[8]刘流，李芸芳，甘飞.人面果叶子的化学成分研究[J].中国中药杂志，2016，41(11)：2098-2104.

[9]Bhandari M R，Nilubon J A，Gao H，et al.α-Glucosidase and α-amylase inhibitory activities of Nepalese medicinal herb Pakhanbhed(Bergenia ciliata Haw.)[J].Food Chemistry，2008，106(1)：247-252.

[10] 季芳，肖国春，董莉.药用植物来源的α-葡萄糖苷酶抑制剂研究进展[J].中国中药杂志，2010，35(12)：1633-1640.

[11] Shi C C，Wu Y W，Lin W C，et al.Antihyperglycemic and antioxidant properties of Anoectochilus Formosanus in diabetic rats[J].Clin Exp pharmacol，2002，29(8)：684-688.

[12] 金雷，薛宏宇，金礼吉.抗氧化剂在糖尿病中的应用研究进展[J].现代生物医学进展，2008，8(2)：383-385.