miR-200b和miR-200c在结肠癌组织中的表达及其临床病理学意义

窦维佳,王景杰,刘震雄

(中国人民解放军空军军医大学(第四军医大学)唐都医院消化内科,西安　710038;#共同第一作者;*通讯作者,E-mail:liuzhx816@126.com)

1　材料与方法

1.1　材料

收集2012-06～2014-06经空军军医大学(第四军医大学)唐都医院手术切除的结肠癌64例,同时在距癌组织边缘>5 cm处的正常组织取标本作为癌旁组织,所有癌组织标本均经病理确诊,癌旁组织确认为无癌细胞及明显炎症细胞浸润。患者共64例,其中男性40例,女性24例,年龄31-76岁,中位年龄57.9岁。所取标本经过液氮速冻后保存在-80 ℃冰箱中用于提取总RNA。所有患者术前均未接受化疗、放疗或生物治疗等相关治疗措施。

1.2　方法

1.2.1RNA的提取取100 mg组织放入液氮预冷的研钵中,将组织块迅速研磨成粉末,置1.5 ml离心管中,加入1 ml Trizol充分匀浆,室温静置5 min;加入0.2 ml氯仿,振荡15 s,静置2 min;4 ℃离心,12 000g×15 min,取上清;加入0.5 ml异丙醇,将管中液体轻轻混匀,室温静置10 min;4℃离心,12 000g×10 min,弃上清;加入1 ml 75%乙醇,轻轻洗涤沉淀。4 ℃,7 500g×5 min,弃上清;晾干,加入适量的DEPC H2O溶解(65 ℃促溶10-15 min);用260 nm波长分光测定RNA浓度,OD值为1相当于大约40 μg/ml的单链RNA。用1 cm光径,用ddH2O稀释DNA样品50倍并以ddH2O为空白对照,根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度:RNA(mg/ml)=40×OD260读数×稀释倍数(50)/1 000。

1.2.2qRT-PCR应用PrimeScript RT reagent Kit试剂盒将提取的RNA反转录为cDNA,37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s。以cDNA为模板应用SYBR Premix Ex TaqⅡ试剂盒进行PCR扩增,变性:95 ℃ 5 min,循环:95 ℃ 10 s,58 ℃ 10 s,72 ℃ 10 s(共45个循环),溶解曲线分析:95 ℃ 5 s,50 ℃ 1 min,97 ℃(1个循环),冷却:40 ℃ 30 s。以U6作为内参,所有引物购自RiBoBio公司。miR-200b引物序列:5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATCGGCACTG CATACGACAAAATATGGAAC-3′(RT引物),5′-TGCGGGTGCTCCGCTCCGCAGC-3′(qRT-PCR正义引物),5′-CAGTGCACGCTCCGA-3′(qRT-PCR反义引物);miR-200c引物序列:5′-GTCGTCCAGTGCAGGGTCCGAGGTAGTTCGCACTGCATACGACGCG GAAC-3′(RT引物),5′-TGCGGTTCACAGTGGCTAAG-3′(qRT-PCR正义引物),5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′(qRT-PCR反义引物);U6引物序列:5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′(RT引物),5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′(qRT-PCR正义引物),5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′(qRT-PCR反义引物),采用2-ΔΔCt分析miRNA的相对表达水平。每个样本设置3个复孔,实验重复3次。

1.3　统计学分析

采用SPSS16.0统计软件对结果进行分析。独立样本t检验分析结肠癌及癌旁组织中miR-200b、miR-200c的表达差异。以平均表达值作为截点将结肠癌组织中miR-200b和miR-200c的表达分为低表达组和高表达组,用卡方检验分别分析miR-200b、miR-200c表达与临床病理指标的关系。Pearson相关系数检测结肠癌组织中miR-200b及miR-200c表达的相关性。所有检验均为双侧,P<0.05被认为差异具有统计学意义。

2　结果

2.1　miR-200b及miR-200c在结肠癌与癌旁组织中的表达

应用qRT-PCR对64例结肠癌及癌旁组织中miR-200b及miR-200c表达分别进行检测,结果表明与正常组织相比,miR-200b在结肠癌中表达明显降低,且差异具有统计学意义(P<0.05,见图1)。同样,miR-200c在结肠癌中的表达较正常组织亦显著降低(P<0.05,见图1)。

与癌旁组织比较,*P<0.05图1　结肠癌与癌旁组织中miR-200b和miR-200c的表达Figure 1　Expression of miR-200b and miR-200c in colon cancer and matched adjacent non-tumor tissues

2.2　miR-200b及miR-200c在结肠癌中的表达及与临床病理特征的关系

分别以miR-200b及miR-200c的平均表达值作为截点将病例分为高表达组和低表达组得到计量资料。miR-200b和miR-200c在结肠癌中呈低表达,卡方检验显示miR-200b和miR-200c在结肠癌组织中的表达显著低于癌旁组织(P<0.05,见表1)。另外,miR-200b及miR-200c的表达与肿瘤的病理分化程度、TNM分期及淋巴转移显著相关(P<0.05,见表2),而与患者的年龄、性别无显著相关性(P>0.05,见表2)。

表1miR-200b及miR-200c在结肠癌和癌旁组织中的表达

Table1ExpressionofmiR-200bandmiR-200cincoloncancerandnon-tumoradjacenttissues

组织nmiR⁃200bmiR⁃200c低表达高表达χ2P低表达高表达χ2P结肠癌组织64432190780003392562240013癌旁组织　6426382440

表2miR-200b及miR-200c的表达与临床病理特征的关系

Table2RelationshipsbetweenexpressionofmiR-200bandmiR-200candclinicopathologicalfeaturesincoloncancer

临床特征nmiR⁃200bmiR⁃200c低表达高表达χ2P低表达高表达χ2P　年龄2278013124110121　　<60岁2816121513　　≥60岁362792412　性别0045083222150137　　男4025152218　　女24186177　分化程度6493001195400002　　高中分化3015151317　　低分化34286268　TNM分期6977000867000010　　Ⅰ-Ⅱ2311121013　　Ⅲ-Ⅳ413292912　淋巴结转移104380001114620001　　否4021191921　　是24222204

2.3　miR-200b及miR-200c在结肠癌中表达的相关性

应用Pearson相关系数对结肠癌组织中miR-200b及miR-200c表达水平进行相关性分析,结果显示两者呈显著正相关(r=0.531,P<0.05,见图2)。

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图2　miR-200b及miR-200c在结肠癌中表达的相关性Figure 2　Correlation between miR-200b and miR-200c expression in colon cancer tissues

3　讨论

结肠癌是常见的消化道肿瘤。近年来,随着经济的发展和生活水平的提高,结肠癌的发病率及死亡率逐年升高,严重危害国民的健康及生命。因此,阐明结肠癌的发生发展机制,找到有效的治疗靶点显得至关重要,但是结肠癌的发病机制尚未完全明确。

MicroRNAs(miRNAs)是一类能在转录后水平发挥调控基因表达的非编码小RNA。大量研究证实miRNAs在结肠癌中发挥癌基因或抑癌基因功能。miR-200b及miR-200c属于miR-200家族,其中包含miR-200a,miR-200b,miR-200c,miR-141以及miR-429等5个成员。研究表明miR-200家族成员在肿瘤增殖、侵袭、转移等行为中均发挥重要的调控作用,且在肿瘤细胞、组织及血浆样本中存在差异表达。miR-200b通过抑制FN1的表达,阻碍耐药乳腺癌细胞EMT过程,发挥抑癌作用[6]。在垂体细胞瘤中,miR-200b下调PKCα表达抑制肿瘤增殖侵袭[7]。miR-200c可通过下调Foxf2表达从而抑制乳腺癌的转移[8]。另外还有研究发现miR-200c可作为判断非小细胞肺癌(NSCLC)预后的指标[9]。Tang等[5]同时研究miR-200b及miR-200c在胃癌中的表达,发现两者在胃癌组织中均呈低表达,且与患者预后显著相关,过表达miR-200b及miR-200c可抑制胃癌细胞恶性生物学行为。虽然miR-200b或miR-200c单独与肿瘤关系的相关报道有不少[10-15],但两者与结肠癌关系并不十分清楚。

我们通过对64例结肠癌患者的癌及癌旁组织进行qRT-PCR检测发现,miR-200b及miR-200c在结肠癌组织中的表达均显著低于癌旁组织。进一步分析两者与结肠癌临床病理学资料的相关性,发现miR-200b及miR-200c表达与肿瘤分化程度、TNM分期、淋巴结转移均相关,即分化程度越低、TNM分期越高、存在淋巴结转移时,miR-200b及miR-200c表达越低,且两者表达呈明显正相关,提示miR-200b及miR-200c均在结肠癌发生发展中发挥抑癌基因的作用,可能为结肠癌的诊治提供新的潜在靶点,但具体的分子机制仍有待进一步深入研究。

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