胃癌组织中COX-2、NF-κB及VEGF的表达及与血管生成的关系

张建军，邹建平，马晓雁，王志恒，刘素芳

(1. 河北省张家口市第一医院，河北 张家口 075000；2. 河北省张家口市万全区中医院，河北 张家口 076250)

胃癌是常见的消化系统恶性肿瘤，也是造成人类死亡的主要原因[1-2]。胃癌的发生、发展与肿瘤细胞的侵袭、迁移密切相关，且以上生物学行为均离不开肿瘤组织中血管新生，而肿瘤血管生成受多种因子调控[3-4]。血管内皮生长因子(VEGF)是目前公认的特异性高、活性最强的血管生长因子，与多种恶性肿瘤的侵袭及预后息息相关；环氧合酶-2(COX-2)可刺激VEGF表达，进而促进微血管及淋巴管的生成；而细胞核因子-κB(NF-κB)是调节细胞基因转录的关键因子，参与多种基因的转录调控，在肿瘤血管生成中也具有重要的调节作用[5-7]。基于以上研究背景，本研究对比分析了胃癌组织及其癌旁组织中VEGF、COX-2、NF-κB的表达情况，并探究了三者表达情况与胃癌患者病理组织中血管生成的关系，现将结果报道如下。

1　临床资料

1.1标本来源选取2015年1月—2016年11月张家口市第一医院收治的69例胃癌患者，均经术前胃镜及术后病理学检查确诊，患者临床资料完整，术前未接受过任何抗肿瘤治疗，且排除伴有其他严重疾病者。69例患者中男39例，女30例；年龄38～79(52.9±8.3)岁。采集所有患者病理组织切片标本，另随机抽取40例患者采集其癌旁组织(距离癌组织边缘2～3 cm)。

1.2主要试剂COX-2多克隆抗体(购于Santa Cruz Biotechnology公司)；兔抗人NF-κB多克隆抗体(购于Santa Cruz Biotechnology公司)；VEGF单克隆抗体(购于新达生化实验公司)；兔抗人CD34多克隆抗体(购于上海沪峰化工有限公司)；SP免疫组化试剂盒(购于上海鲁汶生物科技有限公司)。

1.3实验方法将所有石蜡标本进行常规组织切片，厚度约4 μm，经脱蜡、水化、3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶处理后，以免疫组织化学法进行染色。操作步骤：所有切片常温下复温，滴加合适浓度的一抗：COX-2多克隆抗体/兔抗人NF-κB多克隆抗体/VEGF单克隆抗体/兔抗人CD34多克隆抗体，于37 ℃下孵育30 min，经PBS洗涤，3 min/次，洗3次；同时设立阴性对照(以PBS代替一抗)；滴加二抗：广谱通用型非生物素化IgG，于37 ℃下孵育20 min，经PBS洗涤，3 min/次，洗3次；滴加DAB染色液，显微镜下控制显色反应时间；然后经苏木精复染2 min，梯度乙醇脱水，自然晾干后，以中性树胶封片，于光学显微镜下判定染色结果。

1.4观察指标①观察胃癌组织及癌旁组织中COX-2、NF-κB、VEGF表达情况，以棕黄色颗粒为阳性着色，阳性细胞比例≥10%判定为阳性，否则为阴性。②分析COX-2、NF-κB、VEGF阳性表达胃癌患者的临床病理特征，包括性别、年龄、肿瘤大小及淋巴结转移情况等。③统计COX-2、NF-κB、VEGF不同表达情况胃癌患者的微血管密度(MVD)。以棕色或棕黄色为CD34阳性，计数阳性内皮细胞或内皮细胞簇为1个血管计数，取3个视野的微血管数的平均值即为MVD。

2　结　　果

2.1胃癌组织及癌旁组织中COX-2、NF-κB、VEGF免疫组化染色表现COX-2、NF-κB、VEGF阳性着色主要为棕黄色染色，COX-2及VEGF主要表达于细胞质及细胞膜中，而NF-κB主要表达于细胞核及细胞质中，且胃癌组织中COX-2、NF-κB、VEGF阳性着色更为明显。见图1～6。

图1　胃癌组织中COX-2表达情况(×40)

图2　癌旁组织中COX-2表达情况(×40)

图3　胃癌组织中NF-κB表达情况(×40)

图4　癌旁组织中NF-κB表达情况(×40)

图5　胃癌组织中VEGF表达情况(×40)

图6　癌旁组织中VEGF表达情况(×40)

2.2胃癌组织及癌旁组织中COX-2、NF-κB、VEGF阳性表达情况比较胃癌组织中COX-2、NF-κB、VEGF阳性表达率均显著高于癌旁组织(P均<0.05)。见表1。

表1　胃癌组织及癌旁组织中COX-2、NF-κB、VEGF阳性表达情况比较　例(%)

注：①与胃癌组织比较，P<0.05。

2.3胃癌组织中COX-2、NF-κB、VEGF表达与患者临床病理特征的关系不同性别、年龄、肿瘤大小的胃癌患者胃癌组织中COX-2、NF-κB、VEGF阳性表达率比较差异均无统计学意义(P均>0.05)；淋巴结转移者COX-2、NF-κB阳性表达率显著高于淋巴结未转移者(P均<0.05)，而VEGF阳性表达率比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.4胃癌组织中COX-2、NF-κB、VEGF表达与胃癌患者MVD的关系胃癌组织中COX-2、NF-κB、VEGF阳性表达患者MVD均显著高于阴性表达者(P均<0.05)；且三者均阳性表达者MVD显著高于三者中任意一个阴性表达者(P<0.05)。见表3。

3　讨　　论

在导致胃癌的代谢酶基因中，COX-2的作用最为突出，其过度表达与肿瘤细胞的过度增殖、侵袭及转移等生物学行为息息相关，是肿瘤患者靶向治疗的候选基因之一，已经成为当前胃癌研究领域的热点[8-9]。VEGF与多种恶性肿瘤的发生密切相关，其阳性表达与肿瘤细胞的转移、侵袭及预后也具有明显的相关性[10]。NF-κB是一种基因转录调控因子，具有多向性，通过调控多种基因的转录促进肿瘤血管新生，当NF-κB活化时，会由胞浆转位至细胞核，诱导并促进靶基因mRNA合成，参与COX-2、VEGF及bcl-2等多种基因的调控[11]。本研究结果显示，癌组织中COX-2、NF-κB、VEGF阳性表达率均显著高于癌旁组织，提示三者对胃癌进展及预后具有重要的评估价值；不同性别、年龄、肿瘤大小的胃癌患者胃癌组织中COX-2、NF-κB、VEGF阳性表达率差异均无统计学意义，淋巴结转移者COX-2、NF-κB阳性表达率显著高于淋巴结未转移者，提示COX-2、NF-κB、VEGF表达与胃癌患者性别、年龄、肿瘤大小无明显相关性，而COX-2、NF-κB阳性表达与淋巴结转移与否显著相关；淋巴结转移与否对胃癌患者VEGF阳性表达率无明显影响，可能是由于本研究样本量过小所致，仍需进一步研究确认。

表2　胃癌组织中COX-2、NF-κB、VEGF阳性表达与患者临床病理特征的关系

表3　胃癌组织中COX-2、NF-κB、VEGF表达与胃癌患者MVD的关系

肿瘤新生血管为转移和复发提供了重要通道，在胃癌进展中起关键作用。其中VEGF可直接作用于细胞的有丝分裂原，增加微血管、细血管及小静脉的通透性，还可促进血管内皮细胞分化、增殖，有利于血管新生[12]；COX-2过度表达可上调VEGF、成纤维细胞生长因子等多种与血管生成相关基因的表达，促进肿瘤血管生成；NF-κB则可通过调节上述两者的表达调控胃癌血管生成，可作为胃癌治疗的靶点[13]。本研究结果显示，胃癌组织中COX-2、NF-κB、VEGF阳性表达者MVD均高于阴性表达者，提示COX-2、NF-κB、VEGF高表达均有助于促进胃癌组织肿瘤血管的生成；此外，三者均阳性表达者MVD也显著高于三者中任意一个阴性表达者，提示三者间可能存在明显的协同促进作用，但有关其具体的相关性仍需进一步研究。

综上所述，胃癌组织中COX-2、NF-κB、VEGF阳性表达率显著高于癌旁组织，且三者均可明显促进胃癌组织中肿瘤血管新生，但有关三者间的相互关系仍需进一步深入研究。

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