米象的脉冲微波致死机制研究

豁银强　车　丽　汤尚文 　于　博　贾才华　赵思明

(湖北文理学院1，襄阳　441053) (华中农业大学2，武汉　430070)

微波具有选择性和穿透性，对害虫有较好的杀灭效果。普通微波已成功应用于大米的工业化杀虫防霉，并取得了良好的效果[1-2]。相对于普通微波，脉冲微波是一种间歇发射的微波方式，微波发射的能量短时间内突变后迅速回到初始状态。脉冲微波较之普通微波具有杀虫时间短，能耗低，效率高及运行稳定等优势，是一种有广阔应用前景的杀虫技术[3-4]。近年来，人们将脉冲微波用于液体食品及中药灭菌保鲜，并取得良好的效果[5-6]。我们前期研究表明脉冲微波对大米具有良好的杀灭米象等害虫的效果[7]。相对于普通微波主要利用热效应引起生物体温度升高导致机体死亡，脉冲微波能在不引起明显升温的情况下实现对害虫的杀灭作用，因此，通常认为脉冲微波主要通过引起生物体的非热效应实现杀虫的效果[8]。而有关脉冲微波对米象等粮食储藏害虫致死机理的研究还鲜见报道。

本研究选取脉冲微波剂量、脉冲宽度、脉冲间歇时间、总时间4个因素，研究脉冲微波对米象致死行为、体内碱性磷酸酶活性、乙酰胆碱酯酶活性及表观特征的影响，以期揭示脉冲微波对米象的致死机制，为脉冲微波在大米储藏防虫中的应用提供理论和实践依据。

1.1　材料与试剂

米象，产之湖北十堰，由国家粮食局科学研究院提供，本研究室培养数代。

大米，新优188，湖北黄冈东坡粮油集团提供。生物试剂碱性磷酸酶测定试剂盒和乙酰胆碱酯酶测定试剂盒购于南京建成生物有限公司。其他试剂均为分析纯，购于国药集团。

1.2　仪器与设备

QW-1HO型微波炉：广州科威微波能有限公司；JA12002电子精密天平：梅特勒公司；722S分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；JSM-6390 PLV 型扫描电镜：日本JEOL公司。

1.3　实验方法

1.3.1米象的培养

取无霉变、无虫害小麦，用自来水淘洗5次，去除石子等杂质。将洗净的小麦于70 ℃烘箱中干燥含水量至14%左右，-18 ℃冰箱中冷冻5 d以杀死可能存在的虫卵，做米象饲料。

取洗净烘干的培养瓶，瓶口处均匀涂抹固形物含量为20%的聚四氟乙烯。称取80～100 g恢复至室温的米象饲料，加入约300头米象，于培养瓶中封口，30 ℃恒温培养，每天用湿抹布擦拭培养箱内壁，控制培养箱内湿度在60%以上。

1.3.2脉冲微波处理米象

基于前期脉冲微波杀虫防霉工艺的研究结果[7]，本实验以微波总时间为40 s、间歇时间为100 ms、剂量为10 w/g、脉冲宽度为300 ms作为基本条件，分别调整各因素进行单因素实验，考察脉冲宽度(100、200、300、400、500 ms)、间歇时间(50、100、150、200、250 ms)、总时间(10、20、30、40、50 s)和剂量(2.5、5、7.5、10、12.5、15 w/g)对米象致死行为的影响，每个处理3个重复。

1.3.3米象致死率测定

取羽化1～2 d的米象成虫30头，装入自封袋中，转入一定量的大米，保鲜膜封口，自然状态下培养5 min，将混有米象的大米放入微波炉中进行脉冲微波处理。将处理后的米象倒入白色搪瓷盘中，用软毛笔轻触其腹部，无反应者视为死亡，并记录存活米象的反应状态及爬行情况。米象致死率按下式计算：

米象致死率=死亡米象头数/米象总头数×100%

1.3.4米象体内碱性磷酸酶活性测定

取脉冲微波处理后米象成虫20头，双蒸水清洗两次，去除表面杂质，加入Tris-HCl(pH=7.5)缓冲液1 mL，冰浴下充分研磨成匀浆，加入20%正丁醇0.1 mL，4 ℃下6 000 r/min 离心15 min，取上清液备用。

碱性磷酸酶活性测定按照碱性磷酸酶活测定试剂盒说明书进行。酶活定义为每克组织蛋白在37 ℃与基质作用15 min产生1 mg酚为一个酶活单位。

采用Lowry法测定蛋白质含量。

1.3.5米象体内乙酰胆碱酯酶活性测定

取20头米象，称重后用双蒸水清洗两次，洗净米象表面杂质，按质量/体积1∶27加入85%生理盐水冰浴下充分研磨成匀浆，加入20%正丁醇0.1 mL，4 ℃下6 000 r/min离心15 min，取上清液备用。

按照乙酰胆碱酯酶活力测定试剂盒说明书测定乙酰胆碱酯酶活力。酶活力定义为每毫克组织蛋白在37 ℃保温6 min，水解反应体系中1 μmol基质为1个活力单位。

采用Lowry法测定蛋白质的含量。

1.3.6米象表面形态

微波处理前后米象整体形态用SAMSUNG ST95(1 610万像素)数码相机进行拍照。

米象口部和尾部形态利用扫描电镜进行观察并成像。取脉冲微波处理米象，用生理盐水洗净表面杂质，分别于浓度为50%、60%、70%、80%、90%、100%乙醇溶液中脱水处理5 min。经处理后的米象贴于样品台上喷金固定，进行电镜扫描成像。

1.3.7数据分析

实验中各指标均测定3次重复，3个平行，结果用平均数加标准误表示。用SAS对数据进行方差分析以比较处理间的差异性(P<0.05)；用SAS 8.0中的非线性回归分析程序获得米象致死率的曲线。利用origin 8.0进行图形的绘制。

2　结果与分析

2.1　脉冲微波对米象的致死效应

研究了脉冲微波宽度、间歇时间、总时间及剂量对米象的致死效应。米象致死率随脉冲宽度的延长而增加。当脉冲宽度低于100 ms时，没有米象死亡，仅个别米象爬行速度缓慢，2 h后恢复正常；当脉冲宽度为200 ms时，有少量的米象死亡，尽管未死亡米象出现爬行紊乱等异常情况，但2 h内能恢复正常；脉宽为300 ms以上时，米象致死率大幅度增加，部分存活米象丧失运动能力，并在2 h内自然死亡；当脉宽为500 ms时，米象被全部杀死，米象头部及腹部出现焦黑。米象致死率随脉冲间歇时间延长而降低，当脉冲微波的间歇时间低于50 ms时，米象致死率达100%；当间歇时间为100 ms时，个别米象无爬行能力，2 h后恢复正常；间歇时间200 ms 以上时，米象行为未处理米象相似。延长脉冲微波总时间显著增加米象致死率，微波作用总时间在20 s以内，米象无死亡现象，但脉冲微波作用导致米象行动迟缓、爬行过程中容易出现摔倒等现象；脉冲微波总时间为50 s时，米象致死率为100%，且米象口器及尾部呈黑色，这可能是由于微波的尖角效应使米象的口器及尾部因温度较高而发生焦化。米象的致死率随微波剂量的增大而增加，当微波剂量在5 w/g以内时，米象的致死率较低，米象表现活跃，仅少量米象爬行能力丧失，但随后又恢复；剂量为7.5 w/g的脉冲微波处理米象无爬行能力，并存活米象均在2 h内死亡；当剂量达到10 w/g时，米象致死率达到100%。

图1　脉冲微波前后米象外貌形态

脉冲微波处理前后米象的整体形态如图1。未处理米象表面红褐色，少数米象头部黑色，背部褐色斑不明显，足部张开，触角向前伸展，爬行速度较快。一定条件脉冲微波处理后米象死亡，身体卷曲、僵硬，背部褐色圆斑突出，口器颜色加重且下垂，足部弯曲蜷缩，触角合拢下垂，可能是由于脉冲微波的尖角效应导致米象体内蛋白质等生物大分子发生变性。

2.2　脉冲微波对米象酶活性的影响

2.2.1脉冲微波对米象乙酰胆碱酯酶活性的影响

中枢神经系统是微波辐射最敏感的靶部位，微波辐照能够导致胆碱类神经递质代谢紊乱[9]。不同脉冲微波处理条件下米象体内乙酰胆碱酯酶(AChE)活力如图2所示。脉冲微波处理后米象体内的AChE活性较未处理样品低，米象体内的AChE活性随脉冲宽度的增加而降低。脉宽为100 ms时，AChE活性与未处理样品无明显差异，500 ms脉宽处理米象的酶活性最低。AChE活性随脉冲微波间歇时间的延长而逐渐升高，但均低于未处理样品，脉冲微波间歇时间低于150 ms时酶活力均较低。随脉冲微波处理总时间延长，酶活力呈现出逐步降低的趋势，处理总时间大于30 s时，酶活力降低至较低水平。AChE活性随脉冲微波剂量增加而显著降低，在微波剂量低于7.5 w/g条件下， AChE活性随微波剂量增加而降低，在微波剂量高于7.5 w/g后趋于平稳。

a 固定微波总时间为40 s、间歇时间为100 ms、剂量为10 w/g

b 固定微波总时间为40 s、剂量为10 w/g、脉冲宽度为300 ms

c 固定间歇时间为100 ms、剂量为10 w/g、脉冲宽度为300 ms

d 固定微波总时间为40 s、间歇时间为100 ms、脉冲宽度为300 ms图2　脉冲微波对米象乙酰胆碱酯酶活力的影响

微波场的量子能作用于生物体内的蛋白质和核酸等生物大分子，一方面导致这些物质内部的次级键发生断裂或重组，另一方面导致大分子体系中分子基团发生构象异常，最终导致丧失生物活性[10]。脉冲微波能在非升温情况下引起蛋白质构象改变丧失活性[11]。本研究发现，即使在脉冲微波处理没有引起温度显著升高的情况下，AChE活性也出现不同程度的降低。因此，推测其可能是微波的非热效应引起AChE分子构象改变导致活性降低。当AChE活性降低时，乙酰胆碱在突触部位大量积累，不断激活突触后膜上的乙酰胆碱受体，突触后神经长时间处于兴奋状态，突触部位的正常神经传导受阻，最终导致生物体死亡。

2.2.2脉冲微波对米象碱性磷酸酶活的影响

不同脉冲微波处理米象体内碱性磷酸酶(ALP)活性变化如图3所示，脉冲宽度100 ms时酶活性较未处理样品略有升高，表现出低脉宽微波对ALP酶有一定的激活效应，随着脉宽进一步增大，ALP活性出现降低趋势。ALP活性随间歇时间延长先略有升高，随后逐渐下降，脉冲间歇时间大于200 ms以后其活性接近未处理样品。ALP活性随微波总时间延长及微波剂量增加均呈现出下降的趋势。早期研究报道，微波辐照会降低溶液中的ALP活性[12]。ALP参与生物体内的磷代谢和钙代谢等过程，在昆虫的发育、神经传导、激素合成、物质代谢等过程中起着重要作用[13]，同时也会影响到细胞内钙离子的跨膜运输以及神经组织中细胞的分化和增殖[14]。

a 固定微波总时间为40 s、间歇时间为100 ms、剂量为10 w/g

b 固定微波总时间为40 s、剂量为10 w/g、脉冲宽度为300 ms

c 固定微波总时间为40 s、间歇时间为100 ms、脉冲宽度为300 ms

d 固定间歇时间为100 ms、剂量为10 w/g、脉冲宽度为300 ms图3　脉冲微波对米象ALP酶活力的影响

2.3　米象致死率、米温及酶灭活率之间的相关性分析

为了揭示脉冲微波杀死米象的作用机制，分析了米象致死率、米样温度、碱性磷酸酶活力及乙酰胆碱酯酶活力之间的相关性。

表1　米象致死率与温度及酶活间相关性分析

注：*，**分别表示P<0.05和P<0.01显著水平。

米象致死率与米温、碱性磷酸酶活性及乙酰胆碱酶活性之间的相关性如表1。由表1可知，米象致死率与米样温度间存在极显著正相关性(P<0.01)，相关系数达到0.95，说明米温升高是引起米象死亡的主要因素；米象致死率与乙酰胆碱酶之间存在极显著的负相关，说明乙酰胆碱酶灭活可能一定程度上导致米象死亡。米象致死率与碱性磷酸酶之间不存在显著的相关性，推测碱性磷酸酶部分失活可能并不能直接导致米象死亡。

图4a为米样温度与米象致死率之间的关系图。由图4a可以看出，米象致死率随着米样温度的升高而呈现增加的趋势，但米样温度接近55 ℃时，脉冲微波就几乎杀灭了所有的米象。但在脉冲总时间40 s，间歇时间100 ms，微波剂量10 w/g，脉冲宽度为200 ms条件下，米样温度仅从20.3 ℃升高到26.6 ℃，而有11.7%的米象发生死亡，推测其可能主要是由脉冲微波的非热效应引起的，米象在脉冲微波的热效应和非热效应联合作用下死亡。相对于水浴加热，微波能在较低的温度下杀死大肠杆菌等生物体[15]。脉冲微波处理引起部分存活米象容易摔倒，可能是由于脉冲微波干扰了米象的神经系统。微波对生物神经系统的影响受到越来越多的关注。微波辐射可引起小鼠学习记忆能力下降和神经行为改变[16]。一定剂量微波辐射，可影响大鼠学习记忆功能并引起大鼠海马组织中氨基酸类、胆碱类神经递质代谢紊乱[17]。

图4b为乙酰胆碱酶活性与米象致死率之间的关系图。由图4b可以看出，米象致死率随乙酰胆碱酶活性降低而升高，当乙酰胆碱酶活性低于0.3U/gpro时，米象的致死率达80%以上；乙酰胆碱酶活性高于0.75 U/gpro时，并没有米象发生死亡。而当乙酰胆碱酶活性为0.35～0.57 U/gpro之间时，米象的致死率出现较大的波动，这可能是由于不同处理条件下的非热效应对乙酰胆碱酶活性的杀灭作用和对米象的致死效应不一致引起的。

图4　米温(a)和乙酰胆碱酶活性(b)与米象致死率的关系

参考文献[1]，构建了不同米样温度下米象的热致死动力学模型：

式中：T0(℃)表示米象开始致死时的米温，T1(℃)是米象100%死亡时的米温。常数A是反映米象致死难易程度的敏感因子，常数m是拟合模型的系数。

温度对米象致死的实验值和拟合值曲线如图5，从图5可以看出拟合值与实验值比较接近。该拟合模型的m值为2.9，表明模型比较适合用来表征米象的温度致死特性。拟合模型的T0为25 ℃，表明脉冲微波条件下，米样温度在接近室温时就开始有米象死亡，说明脉冲微波的非热效应比较明显，T1为65 ℃，该值与实验结果比较一致。温度在T0～T1范围内，A值为68，表明米象在所研究条件下对微波引起的温度非常敏感。工业化连续微波炉处理条件下，米象的A值仅为0.042[1]，该值与本实验的值相差较大，表明米象对脉冲微波的热效应更加敏感，也可能是由于脉冲微波对米象的非热效应比普通微波的非热效应更显著，非热效应可能对热效应有协同作用，而导致米样温度小幅度变化就引起米象致死率显著增加。

图5　温度对米象致死率影响的实验值与拟合值曲线

2.4　脉冲微波对米象表观形态的影响

图6为不同脉冲宽度条件下脉冲微波处理对米象口器的影响。由图6可以看出，不同脉宽微波处理米象口器表现出一定的差异，脉冲微波处理引起米象口器部位蜡质发生融化现象，融化程度随微波脉宽的增加而加剧。改变脉冲微波总时间、脉冲剂量及脉冲间歇时间，米象口器也随之发生类似的变化。随着微波间歇时间缩短及总时间延长，米象口器变得较模糊。脉冲微波剂量与米象口器模糊程度间无明显的正相关，其可能是由于脉冲微波对米象口器的影响是热效应和非热效应综合作用的结果。脉冲微波辐照引起米象口器发生异常，进而影响米象的呼吸及摄食导致米象死亡。

图6　脉冲微波对米象口器形态的影响

图7为不同脉冲宽度下脉冲微波处理对米象尾部的影响。从图7可以看出，脉冲微波引起米象尾部发生较大的变化。增加脉冲宽度，米象尾部张开、生殖器外露。延长脉冲微波总时间、增加微波剂量及缩短脉冲间隔时间均引起米象尾部出现类似的情况。其中脉冲微波总时间对米象尾部形态的影响较大，当脉冲微波总时间为50 s时，米象尾部向外突出，并出现小裂纹。脉冲微波处理引起米象尾部出现异常，可能会对米象的排泄功能产生影响，从而导致米象死亡。

图7　脉冲微波对米象尾部形态的影响

3　结论

脉冲微波宽度、间歇时间、总时间及微波强度均对米象有显著的影响。脉冲微波不仅会引起米象死亡，也会引起未死亡米象行为发生异常。脉冲微波处理后米象致死率与米样温度呈显著的正相关，当米样温度高于56 ℃时米象致死率接近100%。米象致死率与乙酰胆碱酯酶活性呈现显著的负相关，乙酰胆碱酯酶活性低于0.3 U/gpro时，米象的致死率达到80%以上，因此推测乙酰胆碱酶失活可能是引起米象死亡的因素之一。碱性磷酸酶活性与米象致死率间不存在显著的相关性。脉冲微波处理引起米象出现身体僵硬、身体发黑等症状。脉冲微波处理也会引起米象口器和尾部出现异常，进而影响米象的呼吸、摄食和排泄而导致米象死亡。因而说，脉冲微波辐照对米象致死既有热效应，也存在非热效应，是热效应和非热相应联合作用的效果。

[1]ZHAO S, QIU C, XIONGS, et al. A thermal lethal model of rice weevils subjected to microwave irradiation[J]. Journal of Stored Products Research, 2007, 43(4):430-434

[2]ZHAO S, XIONG S, QIU C, et al. Effect of microwaves on rice quality[J]. Journal of Stored Products Research, 2007, 43(4):496-502

[3]周蔚红, 张钧. 电磁脉冲灭菌研究[J]. 微波学报, 2000, 16(3):113-116

ZHOU W, ZHANG J. Study on the disinfection technology of electromagnetic pulse[J]. Journal of Microwares, 2007, 43(4):496-502

[4]聂少伍, 黄汉英, 胡月来,等. 基于PLC谷物脉冲微波杀虫机自动控制系统[J]. 制造业自动化, 2014(19):142-144

NIE S W, HUANG H Y, HU Y L, et al. The automation control system based on PLC for grain pulse microwave insecticidal machine[J]. Manufacturing Automation, 2014,19:142-144

[5]卢智远, 石频频, 朱满座,等. 微波及高强电磁脉冲灭菌的机理分析[J]. 生物医学工程学杂志, 2008, 25(4):811-813

LU Z Y, SHI P P, ZHU M Z, et al. Study of microorganism sterilization by instant microwave and electromagnetic pulse[J]. Journal of Biomedical Engineering, 2008, 25(4):811-813

[6]方婷, 龚雪梅, 胡辉养,等. 高压脉冲电场处理菠萝汁及其贮藏期间微生物变化研究[J]. 贵州大学学报(自然版), 2009, 26(6):70-74

FANG T, GONG X M, HU H Y, et al. Study on pineapple juice treated by PEF and its microbial changes during storage[J]. Journal of Guizhou University, 2009, 26(6):70-74

[7]曾淑薇, 车丽, 黄琪琳,等. 大米脉冲微波杀虫防霉工艺优化[J]. 华中农业大学学报, 2015(2):106-112

ZENG S W, CHE L, HUANG Q L, et al. Optimal technology of preventing rice storage pests and mildew by pulsed microwave[J]. Journal of Huazhong Agricultural University, 2015, 2:106-112

[8]LU S T, DE LORGE J O. Biological effects of high peak power radio frequency pulses[M]. Advances in electromagnetic fields in living systems. Springer US, 2000: 207-264

[9]马迪, 彭瑞云, 高亚兵,等. 微波辐射对大鼠学习记忆与海马组织中神经递质的影响研究[J]. 军事医学, 2011, 35(2):104-106

MA D, PENG R Y, GAO Y B, et al. Effects of microwave radiation on learning and memory in rats and their hippocampus neurotransmitters[J]. Military Medical Sciences, 2011, 35(2):104-106

[10]HONG S M, PARK J K, TEERADEJ N, et al. Pretreatment of sludge with microwaves for pathogen destruction and improved anaerobic digestion performance.[J]. Water Environment Research, 2006, 78(1):76-83

[11]LAURENCE J A, FRENCH P W, LINDNER R A, et al. Biological effects of electromagnetic fields-mechanisms for the effects of pulsed microwave radiation on protein conformation[J]. Journal of Theoretical Biology, 2000, 206(2): 291-298

[12]HOMENKO A, KAPILEVICH B, KORNSTEIN R, et al. Effects of 100 GHz radiation on alkaline phosphatase activity and antigen antibody interaction[J]. Bioelectromagnetics, 2009, 30(3):167-175

[13]王秋颖. 碱性磷酸酶特性及其应用的研究进展[J]. 中国畜牧兽医, 2011, 38(1):157-161

WANG Q Y. Advances on characteristic and application of alkaline phosphatase[J]. China Animal Husbandry & Veterinary Medicine, 2011, 38(1):157-161

[14]YANG M Y, WANG Z, MACPHERSON M, et al. A Novel Drosophila Alkaline Phosphatase Specific to the Ellipsoid Body of the Adult Brain and the Lower Malpighian (Renal) Tubule[J]. Genetics, 2000, 154(1):285-97

[15]HONG S M, PARK J K, TEERADEJ N, et al. Pretreatment of sludge with microwaves for pathogen destruction and improved anaerobic digestion performance.[J]. Water Environment Research A Research Publication of the Water Environment Federation, 2006, 78(1):76-83

[16]孟谦谦. 微波辐射对人及小鼠神经行为的影响[D]. 苏州：苏州大学, 2008

MENG Q Q. Effects of microwave radiation on neurobehavioral of human and mice[D].Suzhou: Suzhou University, 2008

[17]张明, 李盾, 陈仪本,等. 乙酰胆碱酯酶分子生物学研究进展[J]. 农药, 2006, 45(1):8-11

ZHANG M, DUN L I, CHEN Y B, et al. Research progress in acetylcholinesterase molecular biology[J]. Agrochemicals, 2006, 45(1):8-11.