利用农业废弃物对青霉菌进行固态发酵生产纤维素酶

訾　慧， 白洪志， 王　惠， 韩晓日， 刘　宁， 黄玉茜， 韩　梅， 杨劲峰

(1.沈阳农业大学土地与环境学院，辽宁沈阳 110866； 2.沈阳农业大学生物科技学院，辽宁沈阳 110866)

木质纤维素是所有植物的基石，并普遍存在于地球的大部分地区，木质纤维素的化学组成使其成为巨大的生物技术价值的基材。纤维素、半纤维素和木质素的基本化学结构对木质纤维素的构架能产生深远的影响[1]。利用生物质过剩、农业废弃物和农产品加工业废渣生产新能源的概念，生物发酵得到了越来越多的关注。因为随着石化燃料由短缺变枯竭，能源是人类面临的共同问题。寻找新的能量来源关系到经济的可持续发展乃至人类的生存[2]。

固态发酵作为纤维素生物转化的手段，在过去的几十年中，利用固态发酵技术生产大量化学品和酶有逐渐增加的趋势[3]。固态发酵和液态发酵之间的直接比较是非常困难的，主要由于这2种技术使用了不同的微生物浓度，但固态发酵中的微生物具有更高的代谢能力，因为它们在接近自然的环境下增殖。这种方法能通过比液态发酵能源需求少、发酵罐体积小、污染物排放少等特点来产生更稳定的产品[4]。

微生物所产生的纤维素酶系是一个多组分酶系，通常将纤维素分为内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶[5]。在工业生产过程中所用的纤维素酶是主要由真菌分泌的胞外酶。所述酶可以有效地降解木质纤维素底物的纤维素链，以产生更小的糖单元如纤维二糖和葡萄糖[6]。纤维素酶在食品、酿造行业、农副产品、深加工饲料、医药、环境保护和化工等领域有非常广阔的应用前景和应用潜力。

1　材料和方法

1.1　筛选培养基

1.1.1富集培养基将粉碎的秸秆装入150 mL三角瓶中，每瓶5 g，加7.5 mL无机盐溶液，封口膜封口，121 ℃灭菌1.5 h。

无机盐溶液：(NH4)2SO43.000 0 g、FeSO4·7H2O 0.005 0 g、KH2PO41.000 0 g、MnSO4·H2O 0.001 6 g、MgSO4·7H2O 0.500 0 g、ZnSO4·7H2O 0.001 7 g、CaCl2·H2O 0.114 0 g、CoCl20.002 0 g、NaCl 0.100 0 g、蒸馏水1.000 0 L。

1.1.2综纤维素培养基次氯酸钠脱除木质素法：称取一定量的原料，加入pH值为4.2～4.7的次氯酸钠溶液，在75 ℃下处理2 h，然后用清水洗至中性，烘干得到综纤维素。

加浓的Mandels盐溶液：KH2PO43.0 g、(NH4)2SO42.0 g、尿素0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、CaCl20.5 g、FeSO4·7H2O 1.5 mg、MnSO4·H2O 2.5 mg、ZnSO42.0 mg、CoCl 3.0 mg，pH值约5.5。

1.1.3滤纸条培养基在加浓的Mandels盐溶液中添加 20 g 琼脂，倒好平板后铺1片滤纸片在培养基上。

滤纸处理：使用前将其用1%醋酸溶液浸泡24 h以除去淀粉，用碘检验，再用2% NaHCO3溶液洗至中性晒干。

1.1.4羧甲基纤维素钠(CMC-Na)培养基CMC-Na 15.0 g、NH4NO31.0 g、酵母粉1.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KH2PO41.0 g、ddH2O 1.0 L、琼脂20.0 g，pH值自然。

1.1.5微晶纤维素培养基下层：在加浓的Mandels营养盐溶液中加入2%琼脂。上层：在加浓的Mandels盐溶液中加入1.5%球磨微晶纤维素粉(微晶纤维素用2 mm玻璃珠 200 r/min 振荡24 h)、2%琼脂。于9 cm平皿中倒入下层培养基约15 mL，待凝固后加入上层培养基，使其成为均匀的薄层备用。

1.1.6马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基马铃薯200 g或葡萄糖20 g、琼脂15～20 g、水1 L，pH值自然。

马铃薯去皮，切成块，煮沸30 min，然后用纱布过滤，再加糖及琼脂，溶化后补足水至1 L，121 ℃灭菌30 min。

1.1.7复筛培养基稻草粉2.30%、蛋白胨0.30%、硫酸铵 0.20%、酵母膏0.05%、KH2PO40.40%、CaCl2·2H2O 0.03%、MgSO4·7H2O 0.03%。

试验所有化学品和试剂均为分析纯。

1.2　菌种的分离和纯化

土壤样品采自长白山自然保护区和柴垛附近。把样品装到无菌采样袋中，标记并保存在4 ℃冰箱中，做进一步的分析工作。将土壤样品在富集培养基中28 ℃培养7 d，并连续转接3次，1式3份[7]。用PDA培养基进行分离菌株，把所有分离的菌株接种到PDA斜面上后，在4 ℃下保存。然后，用综纤维培养基[8]、滤纸条培养基[9]、CMC-Na培养基[10]和微晶纤维素培养基[11]的方法对分离的菌株进行筛选。

为了使透明水解圈清晰可见，笔者所在实验室采用双板法，先在培养皿中铺上1层固体透明的基本琼脂培养基，待其凝固后再铺上1层薄薄的含综纤维素的培养基，既保证了培养基的筛选选择性，又不至于太难筛选到需要的菌株。将分离得到的单菌落接种于CMC-Na平板上，28 ℃培养4 d后取出，倒入适量配制好的1 mg/mL刚果红溶液，放置30 min后，用蒸馏水温和漂洗，最后倒入适量1 mol/L NaCl溶液，放置30 min。以透明圈直径和菌落直径的比值为标准，初步判断各个菌落产纤维素酶的能力。

1.3　分子鉴定分离的真菌

形态结构及生理生化特征的鉴定，采用点种法在PDA培养基上观察菌落形态。ITS序列鉴定：以提取所述菌株的基因组总DNA为底物，以ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCT GCGG-3′)为正向引物、ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATG C-3′)为反向引物对菌株进行18S rDNA扩增。PCR在Taq酶说明书[天根生化科技(北京)有限公司]的标准条件下进行。将该PCR产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，测得序列与NCBI数据库进行比对分析，选取同源性较高的模式菌株进行系统发育分析，借助MEGA 6.06软件构建系统发育树[12]。

1.4　酶活性的测定

对固体发酵培养基进行酶活性测定。向培养基中加入一定体积的蒸馏水，在30 ℃、150 r/min条件下振荡浸提1 h，滤纸过滤，10 000 r/min离心15 min。将澄清的上清液用作粗酶液[13]。

羧甲基纤维素酶(carboxymethyl cellulase，简称CMCase)和β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，简称β-Gase)活性的测定：在试管中加入 1 mL 底物[1% CMC-Na或0.5%水杨素柠檬酸缓冲溶液(pH值4.8)]及1 mL粗酶液，50 ℃保温 30 min，取出，加入 2 mL DNS试剂，煮沸5 min，冷却后稀释5倍，摇匀，530 nm处测定吸光度，并从标准曲线上查出相应的葡萄糖含量折算成酶活性单位(U/g)。

滤纸酶(filter paper lyase，简称FPase)活性测定：于试管中加入1.0 mL柠檬酸缓冲液(pH值4.8)，Whatman No.1滤纸片[1 cm×6 cm，(50±1) mg]1片，以及1 mL粗酶液，50 ℃ 保温 60 min，取出，加入2 mL DNS试剂，其他步骤同CMC酶活性测定。

酶活性单位定义：在纤维素酶最适反应条件下，1 min水解纤维素底物产生1 μg还原糖的量定义为1个酶活性单位，用U/g表示。

1.5　生产纤维素酶工艺参数的优化

对各种工艺参数，如发酵时间(24～168 h)、培养基初始pH值(3～8)、培养温度(20～45 ℃)、接种量(0.5～3.0 mL/3 g 底物)、料水体积比(1.0 ∶1.0～1.0 ∶3.5)、底物粒径、不同氮源(硝酸钠、硫酸铵、硝酸钾、花生饼粉、蛋白胨、酵母膏)等[14]进行优化。

2　结果与分析

2.1　菌株的鉴定

大多数真菌一直使用传统的分类学和肉眼观察进行鉴定[15]。从土壤中分离出1株产纤维素酶菌株，命名为ZH1，将该菌株在PDA培养基中28 ℃培养7 d进行形态的鉴定。该菌株的营养体为绿色的菌丝体，菌丝各细胞之间有横隔膜，分生孢子梗顶端呈特殊的对称或不对称的扫帚状。这些结果表明，这种生产纤维素酶的真菌是青霉菌。由于18S rDNA序列被广泛使用，笔者所在实验室对这种纤维素酶生产菌株的18S rDNA基因进行测序[16]。该菌株的18S rDNA基因序列为551 bp，与NCBI数据库进行比对，由图1可知，ITS序列与ZH1相似性最高的菌株均属于青霉菌属(Penicillium)，该菌株与Penicilliumochrochloronstrain IHB F 2914的18S rDNA序列有较高的同源性。因此，鉴定菌株为赭绿青霉(Penicilliumochrochloron)。

2.2　时间对菌株ZH1生产纤维素酶的影响

由图2可知，在72 h有最大的滤纸酶(FPase)活性，在 48 h 时有最大的CMCase、β-Gase活性。Qaisar等认为，细胞生长能增加抑制酶的生产[17]。因此，生产纤维素酶的最佳培养时间为3 d，进一步培养会增加菌种培育期导致酶活性降低。酶活性的降低可能是由pH值的变化或在发酵过程中细胞代谢导致酶的变性所致[18]。

2.3　初始pH值对菌株ZH1生产纤维素酶的影响

发酵培养基的pH值在发酵过程中对微生物生长产酶有显著的影响，每种微生物的生长均具有最佳的pH值范围。丝状真菌在pH值为3～8的范围内能够良好地生长，极端pH值(过高或过低)可能会导致微生物死亡[19]。由图3可知，在培养基初始pH值为4时有最大的FPase活性和β-Gase活性，CMCase活性最大时pH值为5。这项研究结果与Irfan等利用固态发酵生产羧甲基纤维素酶最佳培养基初始pH值为5的报道[20]相一致。有报道显示，生产β-Gase的最佳pH值为5.0[21]或5.5[22]。

2.4　温度对菌株ZH1生产纤维素酶的影响

培养温度是影响糖化发酵生产酶的一个重要因素[6]。由图4可知，当温度为30 ℃时，FPase、CMCase、β-Gase都有最大的活性。在发酵过程中不同的真菌生产纤维素酶的最佳温度范围为25～45 ℃[18，23]。

2.5　接种量对生产纤维素酶的影响

使用最佳料水体积比，接种量分别调节至0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL/3 g以研究其对生产纤维素酶的影响。由图5可知，接种量为0.5 mL/3 g时有最大的FPase、CMCase、β-Gase 活性。酶产量随着接种量的增加而下降。因此，接种量是生产纤维素酶的一个重要因素。Huang等报道，产酶情况与菌株的生长相关，接种量影响纤维素酶的活性[24]。Raza等通过用麦麸作为底物接种2 mL/10 g黑曲霉和米曲霉的孢子悬浮液，获得最高的β-Gase活性[22]。

2.6　料水体积比对生产纤维素酶的影响

对于固态发酵，真菌喜欢生活在适当潮湿的环境，有利于它们的成长和酶的生产。本试验以稻草为主要底物，研究不同料水体积比对生产纤维酶的影响。由图6可知，1.0 ∶3.0的料水体积比适合生产CMCase、FPase，1.0 ∶2.5的料水体积比适合生产β-Gase。在固态发酵中过多或过少的水量都会影响纤维素酶的生产，维护适当的水分是非常重要的，因为它会影响底物孔隙大小最终影响氧的移动[21]。Mehboob等报道，白腐真菌最佳生产纤维素酶的料水体积比为1 ∶3[25]。绿色木霉使用麦草作为底物生产CMC酶的最优含水量为40%[20]。

2.7　稻草粉底物粒径对生产纤维素酶的影响

底物的粒径(比表面积)对微生物生长非常重要，因为它在糖化发酵过程中传递热与能量[26]。在本试验中使用不同粒径的稻草粉，研究其对生产纤维素的影响。由图7可知，当底物粒径为0.250～0.425 mm 时，比其他尺寸生产的酶活性高。小的粒子激发真菌的生长，因为它提供了较大的表面积，有利于微生物的营养摄取，但会降低传热及氧气与二氧化碳的交换。较大底物粒径(0.850 mm)时，真菌生长被限制，由于表面面积小导致酶生产的降低[27]。这表明稻草粉粒度对菌株生产纤维素酶具有明显影响。

2.8　氮源对生产纤维素酶的影响

氮源是影响菌株产酶的重要因素之一[28]。不同有机和无机氮源(酵母膏、蛋白胨、硫酸铵、硝酸钾、硝酸钠、花生饼粉)的存在能明显影响酶的生产。如图8所示，添加花生饼粉到培养基中，有最大的FPase酶活性。培养基中添加硝酸钠有利于CMCase生产，而添加硫酸铵有利于β-Gase的生产。在这项研究中，有机氮源和无机氮源对酶活性的影响与前人的研究结果[29]相一致。宋贤冲等的研究报告指出，蛋白胨作为氮源最适合绿色木霉生产CMCase[30]。

3　结论与讨论

赭绿青霉菌ZH1菌株固体发酵生产纤维素酶时，在自然补给氧气的条件下，对培养基及培养条件的优化结果为培养基pH值为4，并保持料水体积比为1.0 ∶3.0，最佳氮源为花生饼粉，接种量为0.5 mL，稻草底物粒径为0.250～0.425 mm，有利于纤维素酶活性的提高；在此条件下72 h是适宜的发酵周期。

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