高粱抗蚜反应中抗坏血酸过氧化物酶基因(Sb 002 G 431100)的表达模式分析

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(内蒙古科技大学生命科学与技术学院，　内蒙古 包头 014010)

活性氧(Reactive oxygen species，ROS) 是植物有氧代谢过程中的副产物，包括超氧阴离子 (O2-)、羟自由基 (·OH)、单线态氧和过氧化氢 (H2O2) 等[1]。正常情况下，植物体内活性氧的含量呈现动态平衡状态，不会对植物产生伤害。当病原菌、昆虫侵染植物时，会打破活性氧在植物体内的动态平衡，产生大量的活性氧，形成氧化逆境[2]。活性氧的大量积累会引发或加剧细胞膜的膜脂过氧化和膜脂作用，造成膜系统的损伤，并能引起细胞大分子的氧化损伤，从而对植物造成伤害[3]。

然而，在植物抵御病虫害侵染过程中，活性氧的作用是双方面的，有益或有害取决于它在植物体内的浓度[4]。低浓度的活性氧既可作为毒性分子杀死病原，又可以作为信号分子诱导防御基因的表达，通过引起细胞木质化、胼胝体合成等加固细胞壁结构，阻碍病原的继续入侵[5]。高浓度的活性氧则会给植物体带来极大的危害。当ROS水平超出防御机制所及范围，细胞就处于氧化胁迫状态，引发脂质过氧化、蛋白质氧化、核酸损伤和酶失活，并能激活程序性细胞死亡[6]。

为了消除或降低这种危害，植物体内存在着抗氧化保护酶系统和非酶系统，通过降低植物逆境状态下的活性氧水平，以减少逆境对植物产生的危害[7]。因此，活性氧的积累与及时清除对植物抗病虫害性能的提高具有同等重要的意义。过氧化氢(H2O2)作为活性氧家族中的一员，在植物抵御病虫害侵染过程中扮演着重要角色[8]。本研究利用高粱蚜抗性品种HN 16 (包含RMES1基因[9]) 和感蚜突变体作为研究材料，通过荧光定量PCR的方法，对蚜虫取食过程中活性氧途径关键基因——抗坏血酸过氧化物酶基因(Sb 002 G 431100)的表达模式进行分析，以探明活性氧途径相关基因在高粱抗蚜反应中可能发挥的作用。

1　材料和方法

1.1　材　料

本研究以高粱抗蚜品种HN 16和感蚜突变体作为研究材料。高粱蚜由中国科学院遗传与发育生物学研究所提供，并接种到感蚜品种BTx 623上进行蚜虫的繁殖培养。

RNA 提取试剂TransZol Up和反转录试剂盒购自transgen公司；PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成；DNaseⅠ和SYBR®PremixExTaqTM均购自Takara公司。

1.2　方　法

1.2.1材料处理

在花盆中种植2种高粱材料，待植株长至2叶1心期进行接蚜处理。平均每株苗接蚜20只，选取接蚜0，24，48，72 h和96 h的叶片进行基因表达量分析。所有实验均在培养箱中进行，培养条件为：16 h光照，8 h黑暗，温度28～30 ℃，相对湿度60%。

1.2.2总RNA提取

总RNA 的提取使用TransZol Up试剂。为避免来自基因组DNA的污染，所有的 RNA样品在提取时都要进行DNaseⅠ消化。具体操作如下：取高粱叶片100 mg，放在预冷的研钵中，液氮研磨，迅速转入无RNase 的2.0 mL 离心管，立即加入1 mL TransZol Up提取缓冲液，冰浴5 min；加入200μL氯仿，剧烈震荡30 s，室温放置3 min；4 ℃ 10 000 r/min离心15 min后，取上清到新的离心管；每使用1 mL TransZol Up加入500μL异丙醇，颠倒混匀，室温孵育10 min；4 ℃、10 000 r/min 离心10 min，在管侧和管底形成沉淀；弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀2次，室温将沉淀晾干；加入50～100μL RNase-Free水溶解。检测RNA的质量和浓度，在-70 ℃保存样品。

1.2.3引物设计与合成

从高粱基因组数据库(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)下载抗坏血酸过氧化物酶基因(Sb 002 G 431100)的基因组序列和CDS序列，设计两对跨内含子引物，即引物1(1 F:5′-CTCAGGCAGGTTTTCTCCACA-3′，1 R:5′-GCAAAGAAAGCGTCCTCATCC-3′)和引物2(2 F:5′-GCCTCATCGCTGAGAAGAACT-3′和2 R:5′-GCATAGGATAGGATGGGGAACT-3′)。内参基因引物[10]为(actin F:5′-ACATTGCCCTGGACTACGAC-3′和actin R:5′-AATGAAGGATGGCTGGAAGA-3′)。

1.2.4反转录合成cDNA

按照反转录试剂盒说明进行cDNA的合成。10μL反应体系，反应体系为Total RNA 5μL；Anchored Oligo(dT)primer (0.5μg/μL)1μL；2×TS Reaction Mix 10μL；TransScriptRT/RI Enzyme Mix 1μL；Gdna Remover 1μL；RNase-free Water 2μL。将RNA模板，引物与RNase-free Water混匀，65 ℃孵育5 min后，冰浴2 min，然后加入其他反应组分，42 ℃孵育反转录30 min；85 ℃加热5s失活TransScriptRT/RI与gDNA Remover。反转录获得的CDNA分装20μL小管，每个样品分装5份，-20 ℃保存备用。

1.2.5PCR反应

以DNA和反转录后的cDNA为模板，用引物1和引物2进行PCR程序扩增，PCR反应程序：95 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃ 10 min，10 ℃ 10 min。PCR产物用1%的琼脂糖检测。

1.2.6实时荧光定量PCR(RT-PCR)

采用Takara公司的SYBR®PremixExTaqTM进行PCR扩增，通过检测反应液中SYBR Green I 的荧光强度，达到监控PCR产物扩增量的目的。在Applied Biosystems 7500型荧光定量PCR仪上进行PCR反应。按说明书合成20μL反应体系。反应条件如下：95 ℃，30 s；95 ℃，5 s；58 ℃，34 s，进行40个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s进行溶解曲线分析。

2　结　果

2.1　RNA质量检验

由图1可以看出，所提取RNA的28 S、18 S和5 S条带清晰，且条带间没有拖尾现象，说明RNA质量良好，且没有降解。

RNA的质量检测

2.2　反转录cDNA的质量检测

以反转录的cDNA为模板，取HN 16的基因组DNA作为对照，利用内参基因actin进行扩增发现，扩增条带单一，亮度适中，说明反转录cDNA的质量较好(图2)。

注：M为marker，1为DNA对照，2～6 为HN 0～96 h的cDNA，7～11为Mutant 0～96 h的cDNA。图2　反转录cDNA的质量检测

2.3　特异引物的筛选

利用高粱cDNA和DNA作为模板，对抗坏血酸过氧化物酶基因(Sb 002 G 431100) 的2对跨内含子引物的特异性进行验证，结果表明，2对引物都具有清晰的扩增条带(图3)，均可用于下一步的荧光定量PCR检测，最终选择引物1进行该基因的表达量分析。

图3　引物的筛选

2.4　抗坏血酸过氧化物酶基因(Sb 002 G 431100) 的表达模式分析

利用荧光定量PCR的方法，对蚜虫取食过程中抗坏血酸过氧化物酶基因 (Sb 002 G 431100) 的表达量进行分析，无论是HN 16还是突变体中，该基因的表达模式均呈现先上升后降低的变化规律。在蚜虫取食的最初24 h，该基因在HN 16和感蚜突变体间没有明显差异，但当蚜虫取食48 h后，HN 16中的表达量显著高于突变体，蚜虫取食72 h后突变体中的表达量显著下降，但在HN 16中则始终维持在相对稳定的水平，说明该基因在RMES1介导的抗虫反应中发挥着积极作用。

图4　抗坏血酸过氧化物酶基因 (Sb 002 G 4311001)的表达模式分析

3　讨　论

活性氧(ROS) 对病原菌具有较强的抑制作用，能使植株产生过敏性坏死反应[11]，关于ROS在抗病中的研究已有诸多报道[12]，然而，对 ROS 在植物抗虫中所起作用的研究，目前尚不多见。已有研究表明，活性氧在水稻抗亚洲稻瘿蚊(Orseoliaoryzae)[13]和灰飞虱(Laodelphaxstriatellus)[14]，以及小麦抗黑森瘿蚊(Mayetioladestructor)[15]中起着重要作用。

本研究选取高粱抗蚜品种HN 16 (包含RMES1基因) 和感蚜突变体(RMES1突变) 作为研究材料，对蚜虫取食过程中活性氧途径关键基因——抗坏血酸过氧化物酶基因 (Sb 002 G 431100) 的表达量进行分析发现，该基因的表达在2种材料中均呈现先上升后降低的规律。在蚜虫未侵染及侵染程度较低时 (0～24 h)，该基因在2种材料间的表达量没有明显差异，但当蚜虫取食较为严重时 (48 h后)，HN 16中的表达量显著高于突变体，特别是蚜虫取食72 h后，突变体中的表达量显著下降，但在HN 16中则始终维持在相对稳定的水平，说明该基因在RMES1介导的抗虫反应中发挥着积极作用。为了准确全面探明活性氧在高粱抗蚜反应中的作用机制，下一步还需对活性氧途径中的多个关键基因及抗氧化保护酶系统进行系统研究。

参考文献：

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[3]陈珺.四种观赏植物的活性氧代谢对干旱胁迫的响应[D].浙江农林大学,2013.

[4]张梦如,杨玉梅,成蕴秀,等.植物活性氧的产生及其作用和危害[J].西北植物学报,2014,34(9):1 916-1 926.

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[6]薛鑫,张芊,吴金霞.植物体内活性氧的研究及其在植物抗逆方面的应用[J].生物技术通报,2013(10):6-11.

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[15]Liu X,Williams C E,Nemacheck J A,et al.Reactive oxygen species are involved in plant defense against a gall midge[J].Plant physiology,2010,152(2):985-999.