不同发芽时期桃仁形态结构及氨基酸含量变化

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(1.上海市园林科学规划研究院，　上海 200232；　2.伽蓝(集团)股份有限公司，　上海 201401；3.上海城市困难立地绿化工程技术研究中心，　上海 200232)

桃(Prunspersica)为蔷薇科李属，落叶小乔木，具有较高的观赏和食用价值。桃仁是桃的成熟种子，可入药，《神农本草经》记载，“桃仁味苦平”，具有疏通淤血作用[1]。据报道，桃仁中的化学成分有脂肪油类(油酸、亚油酸和棕榈酸)、苷类、氨基酸和蛋白质、挥发油、黄酮及其糖苷类化合物等[2-3]，是一种优质的可利用植物资源。目前关于桃的研究较多，主要集中在种子萌发、育种、栽培、病虫害防治、果实品质、贮藏保鲜等方面[4-8]，但对桃仁内部形态结构、内含物等方面的研究报道较少。因此，本实验利用合适的温度条件对桃仁进行发芽，通过显微切片观察种子内部形态结构特征，并测定种子内含物中的氨基酸含量，研究种子发芽前后主要化学成分的分布情况和变化趋势，以期为桃仁在食品、化妆品产业中的开发利用提供科学依据。

注：1～16分别是天门冬氨酸，谷氨酸，丝氨酸，组氨酸，甘氨酸，苏氨酸，精氨酸，丙氨酸，酪氨酸，胱氨酸，缬氨酸，蛋氨酸，苯丙氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，赖氨酸。图1　氨基酸标准品的HPLC图谱

1　材料与方法

1.1　材　料

供试材料桃仁为2016年8月采自昆明地区的野生山桃，试验在上海市园林科学规划研究院植物生理试验室内进行。

1.2　方　法

1.2.1种子萌发

4月份，取大小一致的成熟桃仁，用蒸馏水浸种24 h，每10粒种子放入有2层滤纸的培养皿内，盖上盖，置于不同温度的人工智能气候箱中进行培养，温度分别设定为15，20，25，30 ℃，以室温下培养为对照，其他条件：光照度2 000 lx，光照时间12 h/d，重复3次。每天记录种子的萌发状态和数量，计算种子发芽指数和发芽率。

发芽指数=发芽数/发芽日数；

发芽率(%)=全部正常发芽的种子/供试种子总数×100%。

1.2.2内部结构特征显微观察

采用树脂切片方法。取完整的种子，将胚芽部分分割下来，为1 mm左右的小块，先用4 %戊二醛(0.2 mol/L磷酸缓冲液配制，pH=7.2)固定，4 ℃保存。再用2 %锇酸(0.2 mol/L磷酸缓冲液配制，pH=7.2)固定2 h，然后经梯度乙醇脱水和纯丙酮转换后，环氧树脂包埋，样品用半超薄切片机切片，最后用甲苯胺蓝染色，干燥后用光学显微镜进行观测、拍照。

1.2.3氨基酸提取物的制备及测定

氨基酸提取物的制备：取一定质量的不同发芽阶段的桃种子，研钵研碎之后转移至100 mL锥形瓶中，加入8倍体积的55%乙醇，500 W超声反应2 h，过滤，取滤液；滤渣中再加入8倍体积的55 %乙醇，500 W超声2 h，过滤，取滤液；合并滤液后离心，取上清旋转蒸发干燥。

衍生试剂的配置：称取OPA 40 mg，加入3.5 mL 的0.4 mol/L硼酸盐缓冲液(pH=10.4)， 62.5μL 的3-巯基丙酸和0.5 mL的乙腈，混合均匀。

流动相的配置：流动性A：乙腈∶甲醇∶水(45∶45∶10，体积比)。流动性B：称取0.7 g NaHPO4和1.9 g Na2B4O7·10 H2O，溶于400 mL水中，加浓盐酸调到pH=8.2，最后定容到500 mL，0.45μm滤膜过滤。

衍生反应：衍生在Agilent 1260型高效液相色谱仪自动进样器上在线自动完成。程序如下： 1) 吸取15μL硼酸盐缓冲液(pH=10.0)； 2) 吸取2.5μL样品溶液； 3) 混合5次； 4) 等待0.2 min； 5) 吸取2.5μL的OPA试剂； 6) 混合5次； 7) 等待0.1 min； 8) 进样20μL。

HPLC测定：采用梯度洗脱，流速1.5 mL/min，检测波长338 nm，柱温40 ℃，以保留时间定性(图1)，外标法定量。

2　结果与分析

2.1　桃仁萌发温度及发芽动态观察

山桃的种子呈卵形，种皮淡褐色，革质光滑，种子长1.20～1.40 cm，宽0.60～0.90 cm，千粒重319～354 g。在室温条件下，经水浸泡处理的桃仁4 d后开始膨大萌动，之后胚轴伸长，10 d胚根生长，20 d后陆续发芽，整个萌发过程可分为吸胀、萌动、发芽3个阶段(表1)。

表1不同温度条件下桃仁发芽状态

温度(℃)　　阶段1　　　　阶段2　　　　阶段3　　天数(d)发芽指数天数(d)发芽指数天数(d)发芽指数发芽率(%)ck43．75101．50200．5033．31554．40151．33250．6453．32055．60122．08201．0066．72547．50112．73181．4476．63047．50102．80161．5673．3

注：A为桃仁萌发前的结构特征；B为桃仁吸胀过程的结构特征；(放大倍数依次为5×、10×、40×)SC为种皮；E为胚；CO为子叶；pb为蛋白体； s为淀粉粒。图2　不同萌发时期种子内部结构特征

在15～30 ℃范围内，不同温度条件下的桃种子均可发芽，发芽率为33.3%～76.6%，其中在25 ℃条件下的种子发芽率最高。从表1可看出，不同温度处理对种子开始吸胀(阶段1)的时间没有明显的影响，时间为4～5 d；但是对种子萌动(阶段2)、发芽(阶段3)时间存在一定的影响，分别10～15 d和16～25 d，温度越高各阶段间隔时间越短，其中吸胀、萌发和发芽时间最短的是30 ℃。在发芽过程中，在15 ℃条件下培养的种子发芽缓慢，胚根很短，表现不正常；30 ℃条件下发芽的幼苗生长虽然较快，但胚根在萌发后期易褐化，导致已处于阶段3的种子死亡。总体上，25 ℃条件下的种子萌发速度较快、种子发芽率高。

2.2　不同萌发时期桃仁形态结构特征

从萌发前桃仁的纵切面(图2 A-1)观察，可看到内种皮、胚、子叶3个部分。内种皮由两类细胞组成，一种细胞体积较小，细胞内出现大的空泡，细胞之间有黑色颗粒状物质，明显地构成了内种皮的内层，为1～2层细胞；另一种细胞体积较大，细胞中的内含物染色较深，由多层细胞构成。胚细胞呈现胚性细胞的典型特征，小而致密，细胞质浓厚，核大(图2 A-2)。子叶细胞发育完全，细胞排列规则，所贮藏的营养物质成分较多，有利于胚的发育，子叶中含量较多的物质结构是淀粉粒和蛋白体，淀粉粒多呈不规则型，通常每个细胞中含有1～4个淀粉颗粒；蛋白体多呈近圆球形，分布在淀粉颗粒之间的空隙内(图2 A-3)。

桃仁浸种后，种子处于吸胀过程，体内开始发生变化。从图2 B-1、图2 B-2可以明显看出，胚细胞迅速生长，胚芽形成；胚根开始伸长生长。种子内部储存淀粉粒和蛋白体等大分子开始被水解，分解成可溶性的小分子(图2 B-3)。

2.3　桃仁内含物中氨基酸含量变化

对萌发过程中的桃仁进行16种氨基酸含量测定(表2)，在整个萌发过程中精氨酸含量最高，为0.10%～1.46%；其次为谷氨酸含量，为0.06%～0.74%；蛋氨酸，甘氨酸、苏氨酸、酪氨酸、胱氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸等7种氨基酸含量较低，为0.01%～0.05%。

从氨基酸总含量和种类随着种子的萌发进程不断增加。萌发前的氨基酸总量最低，为0.26%，各氨基酸成分含量范围为0.00%～0.10%，并且只检测到9种氨基酸，其中精氨酸含量最高，为0.10%，其次为谷氨酸(0.06%)、苯丙氨酸(0.04%)、甘氨酸(0.02%)，天门冬氨酸、丝氨酸、组氨酸、缬氨酸均为0.01%。萌发阶段1的氨基酸总量为1.86%，检测到除了酪氨酸、胱氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸以外的12种氨基酸种类，其中谷氨酸含量最高，为0.74%。萌发阶段2的氨基酸总量为2.63%，同时检测到了所有16种氨基酸种类。萌发阶段3的氨基酸含量最高，为3.10%，检测到除蛋氨酸以外的15种氨基酸种类。

从同一氨基酸不同的萌发阶段来看，多数氨基酸含量随着桃仁种子的萌发进程不断增加，其高峰值处于萌发阶段3。而天门冬氨酸、谷氨酸含量的高峰值处于第1阶段，之后逐渐降低；丙氨酸含量高峰值处于第2阶段，第3阶段含量降低；赖氨酸的含量在第1阶段达到最高值，之后含量始终保持在0.17%；蛋氨酸含量在萌发前后差异较小，最高值是第2阶段，为0.01%。

表2不同发芽阶段桃仁内含物中氨基酸含量(%)

编号氨基酸萌发前阶段1阶段2阶段31天门冬氨酸0．010．250．210．202谷氨酸0．060．740．590．363丝氨酸0．010．070．160．204组氨酸0．010．040．080．165甘氨酸0．020．020．050．046苏氨酸0．000．010．030．047精氨酸0．100．300．931．468丙氨酸0．020．100．150．129酪氨酸0．000．000．020．0410胱氨酸0．000．000．020．0211缬氨酸0．010．040．040．0512蛋氨酸0．000．000．010．0013苯丙氨酸0．040．090．120．1314异亮氨酸0．000．000．030．0415亮氨酸0．000．020．040．0516赖氨酸0．000．170．170．17总和0．261．862．633．10

3　讨　论

桃种子有休眠现象，加上存在坚硬的内果皮，常出现烂种或隔年发芽现象，田间播种发芽率往往很低[9]。为了充分利用桃仁中的天然有效成分，同时便于后期的提取利用，本研究在播种前去掉核壳，利用可控的人工智能气候箱对桃仁进行不同温度条件下的发芽试验。经水浸泡处理的桃仁4 d后开始膨大萌动，之后胚轴伸长，胚根生长，陆续发芽，整个萌发过程可分为吸胀、萌动、发芽3个阶段，并以25 ℃条件下的种子萌发速度较快、种子发芽率高，为76.6%，与张桂兵等[10]用层积法、开水烫种法处理毛桃种子得到的出苗率差异不大。

从显微结构来看，桃仁的经过前期浸种处理后，最明显的变化就是胚细胞迅速生长，胚芽形成，胚根开始伸长生长；细胞内大量的淀粉粒和蛋白体等物质被降解。种子在萌发的过程中，种胚从生命活动相对静止状态，恢复到生理代谢旺盛的生长发育阶段，体内的储藏物质被转化和利用[11]。这与油松(Pinustabuliformis)[12]、银杏(Ginkgobiloba)[13]、番茄(Lycopersiconesculentum)[14]种子在萌发过程中表现出相似的情况，物质的降解与幼胚的生长同步进行，两者具有密切的联系。

另外，氨基酸及其衍生物易被皮肤吸收，使老化和硬化的表皮恢复弹性，延缓皮肤衰老[15]。在桃仁萌发过程中，贮藏蛋白质在蛋白酶的作用下逐渐分解为氨基酸，氨基酸含量和种类随着种子的萌发进程不断增加。从氨基酸含量来看，精氨酸含量最高，为0.10%～1.46%，其次为谷氨酸含量，为0.06%～0.74%，蛋氨酸，甘氨酸、苏氨酸、酪氨酸、胱氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸等7种氨基酸含量较低，为0.01%～0.05%，这些对于后期桃仁中氨基酸含量的提取和利用提供了理论依据。

参考文献：

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[11]张红生,胡晋主编.种子学[M].北京:科学出版社,2015.

[12]陈丽培.油松种子萌发初始阶段生理生化特性研究[D].南京林业大学硕士论文,2009.

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[14]孟祥红,王建波,韩笑冰,等.番茄种子及萌发过程中蛋白体超微结构的研究[J].西北植物学报,1999,19(1):89-94.

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(本栏目责任编辑：周介雄、戴燚)