不同海棠品种果实糖酸组分测定和聚类分析

穆 茜，张丹丹，杨祎凡，张 晶，胡晓璇，张往祥，2

（1.南京林业大学a.林学院；b.南方协同中心，江苏 南京 210037； 2.扬州小苹果园艺有限公司，江苏 扬州 225200）

海棠MalusSpp.属蔷薇科Rosaceae 苹果属MalusMill.中果实直径≤5 cm 的落叶灌木或小乔木，其抗逆性及适应性强，同时与主栽品种有很强的亲和性[1]。目前，有关海棠的研究主要集中在观花、观叶等方面，而对其果实内在性状品质方面的研究报道却较少。糖酸组分是果实生长发育、产量和品质形成的物质基础，对产量的形成和品质的改良均有重大意义[2]。各种糖酸组分的绝对含量及它们之间的相互作用，决定着果实可溶性固形物、维生素C 含量及果实大小、着色程度、果实货架期等品质特性[3-5]。有关海棠果实内糖酸组分品质特性的研究对于海棠果实的食用、生产、消费和海棠品种的选育与质量评定均有一定的理论意义和实用价值。于淼等[6]采用HPLC 法测定了蓝莓品种果实的糖酸组分及含量。刘丽等[7]和胡琼等[8]分别对果桑和枣吊的果实品质进行了分析评价。何应会等[9]对江南油杉球果种子的品质差异进行了分析评价。杜改改等[10]对6 个杏李品种果实甜酸风味品质进行了分析，结果发现，杏李成熟果实中的糖分积累类型均属己糖积累型，以积累果糖和葡萄糖为主；有机酸的积累以苹果酸为主。刘珩等[11]对13 个海棠品种果实的营养物质进行了测定，并进行了聚类分析，结果发现，其中优质海棠果的营养成分丰富，并具有高酸度的优势，最适合用作果汁生产的原料。这些研究报道初步明确了各品种海棠果的营养成分及其开发利用途径，为进一步开发海棠果的应用价值提供了科学依据。但是，Ma 等[12]对野生型苹果和栽培型苹果的糖酸组分进行分析后发现，有机酸是野生型苹果和栽培型苹果的重要区别物质。同时前人分别对蓝果忍冬[13]、苹果[14]、梨[15]、桃[16]、李[17]等果实的糖酸组分进行了研究，分析确定了不同种类果实的糖酸组分特征及含量。盖瑞等[18]分别采用比色法和滴定法对海棠果实的糖酸含量进行了分析，结果发现，海棠果实内各功能性成分含量均显著高于苹果内的含量，其中海棠果内可溶性总糖、可滴定酸含量最高分别达到苹果的1.86、2.23 倍。

海棠种质基因库中的品种繁多，本研究仅选择其中品质性状较好的16个主栽品种作为试验对象，采用高效液相色谱法（HPLC）对其果实的糖酸组分进行了检测，并采用聚类分析方法对海棠果实的糖酸组分及其含量间的关系进行了分析和分类，旨在揭示海棠果实中糖酸组分的品种特征，从而为海棠果实的开发利用和品种改良提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试材料为2017年8月下旬到10月上旬采集于扬州市江都区海棠种质资源圃中的成熟果实。在此品种资源圃中选择树体、树龄基本一致的果树，根据成熟果实的取样标准（为保证不同品种之间果实成熟度的一致，统一于果实充分着色5 d 后采样）在每个品种树冠中上部相同方位随机采摘25 个果实，用密封袋保存带回实验室，放入-75 ℃的超低温冰箱中保存，用于相关指标的测定。供试的海棠品种名称及编号详见表1。

表1 供试海棠的品种名称及编号Table 1 Tested cultivar names and No.of crabapple (Malus spp.)

1.2 糖酸组分的提取方法

糖酸组分的提取方法，参照辛秀兰等[19]和杜改改等[10]的方法并稍作改进。精密称取海棠果肉2.0 g，放入研钵中，加入NaH2PO4（pH 值为2.4）溶液4 mL 并研磨，当研磨均匀后，转移至10 mL 的容量瓶中定容，超声波提取1 h，以10 000 r·min-1的转速离心15 min，过0.22 µm微孔滤膜，制备出酸待测样品。糖待测样品的制备方法同此，但用于研磨与定容的NaH2PO4溶液应换为超纯水。

1.3 可溶性糖和有机酸的测定方法

糖组分测定的色谱条件为：液相色谱仪为Waters 1525 系统，Waters Abridge C18 柱（250 mm× 4.6 mm，5 µm）色谱柱，柱温25 ℃，流动相为超纯水（0.2%三乙胺）-乙腈（0.2%三乙胺），流速为1 mL·min-1，检测器为蒸发光检测器（Waters 2424），增益值为20，气体压力为30 psi，喷雾器动力级别为20%，漂移管80 ℃，进样量15 µL。根据样品的峰面积和标准曲线计算蔗糖、果糖和葡萄糖的含量。

有机酸测定的色谱条件为：液相色谱仪为Waters2695 系统，色谱柱为Select HSS T3 柱（250 mm×4.6 mm，5 µm），流动相为20 mmol·L-1NaH2PO4（pH 值为2.4，用磷酸调配），以流速分别为0.4、1.0 mL·min-1的梯度洗脱测定，柱温为30 ℃，检测器类型为PDA 二极管检测器，波长为210 nm，进样量为8 µL。根据样品的峰面积和标准曲线计算草酸、酒石酸、苹果酸、和柠檬酸的含量。

1.4 可溶性固形物和维生素C 的测定方法

用PR-101α 全糖仪测定[20]果实中可溶性固形物的含量，用二甲苯萃取比色法[21]测定维生C 的含量；每项指标的测定各重复3 次。

1.5 标准曲线的制作及线性相关性、重复性和回收率的测定

分别准确称取0.2 mg 的蔗糖、葡萄糖和果糖，加入10 L 的超纯水，配成质量浓度为0.02 mg·g-1的糖标准母液。然后将糖标准母液分别稀释成0.12、0.10、0.09、0.06 mg·g-1系列的糖混合标准溶液。再准确称取草酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸各20 mg，加入10 L 的超纯水配成质量浓度为2 mg·g-1的酸标准母液。用超纯水将酸标准母液分别稀释成0.40、0.25、0.20、0.10 mg·g-1系列的酸混合标准溶液。用0.22 μm的微孔滤膜过滤后上机分析，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标求回归方程和相关系数。

将同一份待测的果肉提取液平行测定5 次后，计算标准偏差，以考察仪器的稳定性。采用加标回收率法测定回收率，于样品提取前分别加入0.2 mg·g-1的糖标准溶液和2.0 mg·g-1的酸标准溶液后再测定，对混合样品的测定设5 次重复，根据标准品的加入量与检出量计算回收率。

1.6 总糖、总酸及甜度值的计算方法

甜度值的计算方法：如果以100 来表示蔗糖的甜度，那么葡萄糖为75，果糖为175。

甜度值＝蔗糖含量×100 ＋葡萄糖含量×75 ＋果糖含量×175。

总糖＝蔗糖＋葡萄糖＋果糖；

总酸＝苹果酸＋草酸＋酒石酸＋柠檬酸。

2 结果与分析

2.1 糖酸组分的测定方法

以HPLC 法测定的3 种可溶性糖混合标准品的出峰色谱图如图1所示。图1说明，本试验所采用的色谱条件对各糖组分的分离效果良好，各组分的出峰前后顺序依次为果糖、葡萄糖和蔗糖，保留时间均在6 min 以内。果实样品的出峰色谱图如图2所示。

图1 可溶性糖混合标准品的HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of soluble sugar mixture standards

图2 ‘约翰东’果实样品可溶性糖的HPLC 色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of soluble sugar in M. ‘John Downier’ fruit

采用HPLC 法可以较好地分离出所检样品中的各种有机酸组分，混合标准品各组分的出峰顺序依次为草酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸，保留时间均在16 min 以内（如图3所示）。从供试的果实样品中检测出了4 种有机酸，却未检测出琥珀酸，果实样品的出峰色谱图如图4所示。

糖酸组分的标准曲线、重复性及回收率的测定结果见表2。从表2中可以看出，每种成分的相关系数都在0.990 以上，对同一样品平行测定5 次，各组分糖的平均回收率为 94.52%～99.35%，各组分酸的回收率为 98.66%～99.73%，均达到了分析方法的要求。可见，采用上文1.2 段说明的样品提取方法所得的回收率高且重复性好，说明1.2段所述样品提取方法和1.3 段所述色谱条件适用于海棠果实糖酸组分的测定。

图3 有机酸混合标准品的HPLC 色谱图Fig.3 HPLC chromatogram of organic acid mixture standards

图4 ‘萘微利’果实样品有机酸的HPLC 色谱图Fig.4 HPLC chromatogram of organic acid in M.‘Evil Coleman’ fruit

2.2 16 个海棠品种果实中的糖酸组分和含量分析

不同海棠品种果实中可溶性糖含量的测定结果见表3。由表3可知，不同海棠品种果实中的总糖含量从高到低依次为：‘丽格’＞‘东哥’＞‘萘微利’＞‘红哨兵’＞‘黛玉’＞‘艾琳’＞‘珊瑚礁’＞‘绚丽’＞‘凯尔斯’＞‘百夫长’＞‘约翰东’＞‘皇家宝石’＞‘芭蕾红’＞‘白兰地’＞‘亚当’＞‘赛尔科’。 16 个海棠品种果实中总糖含量的平均值为1.254～4.827 mg·g-1，其变异系数为7.41%。16 个海棠品种果实中均含有果糖、葡萄糖和蔗糖这3 种糖分，3 种糖分含量的平均值从高到低依次为：葡萄糖＞果糖＞蔗糖。其中，果糖的平均含量为0.435～1.934 mg·g-1，含量最高的品种为‘东哥’，含量最低的为‘白兰地’；葡萄糖的平均含量为0.875～2.765 mg·g-1，含量最高的品种为‘丽格’，含量最低的为‘芭蕾红’；蔗糖的平均含量为0.014～0.666 mg·g-1，含量最高的品种为‘萘微利’，含量最低的为‘皇家宝石’。3 种糖分中，果糖的变异系数最大，达9.73%；葡萄糖的变异系数最小，为4.15%。16 个海棠品种果实中，‘东哥’的果糖含量最高，‘丽格’的葡萄糖含量最高，‘萘微利’的蔗糖含量最高。

表2 糖酸组分的标准曲线、重复性及回收率的测定结果†Table 2 Determination results of standard curves,dependability and recovery rates of sugar and organic acid components

不同海棠品种果实中有机酸含量的测定结果见表4。由表4可知，不同海棠品种果实的总酸含量从大到小依序为：‘绚丽’＞‘白兰地’＞‘黛玉’＞‘珊瑚礁’＞‘芭蕾红’＞‘亚当’＞‘凯尔斯’＞‘约翰东’＞‘赛尔科’＞‘百夫长’＞‘红哨兵’＞‘艾琳’＞‘东哥’＞‘皇家宝石’＞‘丽格’＞‘萘微利’。不同海棠品种果实中总酸的平均含量为4.686～17.073 mg·g-1，其变异系数为9.08%。16 个海棠品种果实中均含有草酸、酒石酸、苹果酸和柠檬酸这4种酸，而‘赛尔科’‘芭蕾红’‘皇家宝石’和‘凯尔斯’果实中不含柠檬酸，‘百夫长’和‘亚当’中未发现酒石酸。海棠果实中有机酸含量的平均值由高到低依次为：苹果酸＞柠檬酸＞酒石酸＞草酸。苹果酸的平均含量为3.475～14.266 mg·g-1，含量最高的品种为‘绚丽’，含量最低的为‘萘微利’；柠檬酸的平均含量为0.750～5.692 mg·g-1，含量最高的品种为‘亚当’，含量最低的为‘萘微利’；酒石酸的平均含量为0.069～3.282 mg·g-1，含量最高的品种为‘白兰地’，含量最低的为‘绚丽’；草酸的平均含量为 0.120～0.385 mg·g-1，含量最高的品种为‘赛尔科’，含量最低的为‘白兰地’。柠檬酸的变异系数最大，达19.18%；苹果酸的变异系数最小，为9.76%。16 个海棠品种果实中，‘萘微利’的苹果酸和柠檬酸含量均最低；‘白兰地’的酒石酸含量最高，而其草酸含量最低；‘绚丽’的苹果酸含量最高，而其酒石酸含量最低。

表3 不同海棠品种果实中可溶性糖含量的测定结果†Table 3 Determination results of soluble sugar contents in different cultivars of crabapple fruits

除了酸和糖组分的含量，总甜度、甜酸比、糖酸比也在很大程度上影响果实的甜酸风味和口感。不同海棠品种果实风味的测定结果见表5。由表5可知，不同海棠品种果实总甜度的大小顺序为：‘东哥’＞‘丽格’＞‘萘微利’＞‘艾琳’＞‘红哨兵’＞‘黛玉’＞‘珊瑚礁’＞‘凯尔斯’＞‘绚丽’＞‘约翰东’＞‘百夫长’＞‘皇家宝石’＞‘芭蕾红’＞‘赛尔科’＞‘白兰地’＞‘亚当’。 不同海棠品种果实甜酸比的大小顺序为：‘萘微利’＞‘丽格’＞‘黛玉’＞‘东哥’＞‘艾琳’＞‘红哨兵’＞ ‘皇家宝石’＞‘芭蕾红’＞‘百夫长’＞‘凯尔斯’＞‘赛尔科’＞‘珊瑚礁’＞‘约翰东’＞‘绚丽’＞‘亚当’＞‘白兰地’。不同海棠品种果实糖酸比的大小顺序为：‘丽格’＞‘萘微利’＞‘东哥’＞‘红哨兵’＞‘艾琳’＞‘皇家宝石’＞‘百夫长’＞‘黛玉’＞‘珊瑚礁’＞‘凯尔斯’＞‘赛尔科’＞‘约翰东’＞‘绚丽’＞‘芭蕾红’＞‘亚当’＞‘白兰地’。由此可以看出，‘萘微利’和‘丽格’果实的总甜度、甜酸比和糖酸比其它品种都好；就果实的总甜度而言，‘东哥’＞‘丽格’＞‘萘微利’，但受有机酸的影响，其甜酸比的大小顺序为：‘萘微利’＞‘丽格’＞‘黛玉’。

2.3 16 个海棠品种果实中的维生素C 含量和可溶性固形物含量分析

16 个海棠品种果实中可溶性固形物和维生素C的含量如图5所示。由图5可知，16 个海棠品种果实中维生素C 的含量相差较大，而果实中可溶性固形物的含量相差较小。16 个海棠品种果实中维生素C 的平均含量为130.012～282.617 mg·g-1，16 个海棠品种果实中维生素C 含量的平均值由高到低依次为：‘丽格’＞‘东哥’＞‘萘薇利’＞‘红哨兵’＞‘亚当’＞‘白兰地’＞‘绚丽’＞‘百夫长’＞‘约翰东’＞‘赛尔科’＞‘芭蕾红’＞‘黛玉’＞‘凯尔斯’＞‘艾琳’＞‘皇家宝石’＞‘珊瑚礁’。其可溶性固形物的平均含量为12.73%～17.40%，其平均含量（百分比）由高到低依次为：‘萘微利’＞‘东哥’＞‘丽格’＞‘约翰东’＞‘绚丽’＞‘赛尔科’＞‘红哨兵’＞‘亚当’＞‘珊瑚礁’＞‘黛玉’＞‘百夫长’＞‘白兰地’＞‘皇家宝石’＞‘芭蕾红’＞‘艾琳’＞‘凯尔斯’。

表4 不同海棠品种果实中有机酸含量的测定结果†Table 4 Determination results of organic acid contents in different cultivars of crabapple fruits

表5 不同海棠品种果实风味的测定结果Table 5 Determination results of fruit flavor of different cultivars of crabapple

图5 16 个海棠品种果实中可溶性固形物和维生素C 的含量Fig.5 Contents of soluble solids and vitamin C in sixteen cultivars of crabapple fruits

2.4 16 个海棠品种果实的感官评价

根据Harker 等[22]对果实风味、气味、口感质地的定义来制定感官评分标准（见表6），再依据此标准对16 个海棠品种果实进行感官评价，结果见表7。由表7可知，16 个海棠品种果实的感官评价总分从高到低依次为：‘丽格’＞‘东哥’＞‘萘微利’＞‘红哨兵’＞‘黛玉’＞‘艾琳’＞‘赛尔科’＞‘约翰东’＞‘百夫长’＞‘珊瑚礁’＞‘凯尔斯’＞‘芭蕾红’＞‘皇家宝石’＞‘绚丽’＞‘白兰地’＞‘亚当’。16 个海棠品种果实感官评价总分在9.666～33.000 之间，其变异系数为6.18%；其果实风味的评分在1.666～8.833 之间，其中，‘丽格’的风味评分最高，‘白兰地’和 ‘亚当’的风味评分均最低；其气味评分在2.666～7.833 之间，其中，‘丽格’和‘萘微利’的气味评分均最高，而‘亚当’的气味评分最低；其外观评分在3.500～7.571 之间，其中，‘东哥’的外观评分最高，而‘白兰地’的外观评分最低；其口感评分在1.500～8.833 之间，其中，‘丽格’的口感评分最高，而‘白兰地’和‘亚当’的口感评分均最低；供试海棠果的各项感官评价指标的平均标准偏差在0.408～1.751 之间，表明各项感官评价指标的分布较均匀。同时，各感官评价指标及感官评价总分的变异系数在6.18%～13.32%之间，说明16 个海棠品种果实感官品质间的差异不大。

2.5 16 个海棠品种果实糖酸组分的聚类分析

综合16 个海棠品种果实的果糖、葡萄糖、蔗糖、草酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸和总甜度、糖酸比和甜酸比这10 项指标进行聚类分析，应用SPSS 13.0 与MEGA 5.0 软件对海棠果实这10 项糖酸指标数据进行系统聚类分析，将距离相近的果实聚为一类，从而对其果实的综合品质进行分类[2]，结果如图6所示。聚类分析结果表明，16 个海棠品种果实可分为如下4 类：第1 类主要包括种质编号分别为A7、A9、A10 的果实，此类果实的果糖、蔗糖含量均高，而其苹果酸、柠檬酸含量均低，其总甜度、甜酸比和糖酸比均高，果实整体口感好，偏甜；第2 类主要包括种质编号分别为A4、A5、A16 的果实，此类果实中的葡萄糖含量较高，而蔗糖含量较低，其总甜度、甜酸比和糖酸比仅次于第1 类，果实整体口感较好，酸甜；第3 类主要包括种质编号分别为A1、A2、A3、A6、A8、A11、A12 和A14 的果实，此类果实中的苹果酸含量高，而柠檬酸含量较高，其总甜度仅次于第2 类，果实整体口感不理想，偏酸；第4 类主要包括种质编号分别为A13 和A15 的果实，此类果实中的草酸和酒石酸含量均较高，而其总甜度、甜酸比和糖酸比均偏低，果实整体口感不好，果实酸。

表6 海棠果的感官评价标准Table 6 Sensory evaluation criteria for crabapple fruits

3 讨论与结论

本研究采用高效液相色谱法（HPLC）分离并测定了16 个海棠品种果实中的可溶性糖和有机酸，对样品的前处理和操作简单便捷，而且具有良好的灵敏度和精密度，可以同时实现对不同糖酸组分类型果实样品的分析与测定，这对于其它海棠品种果实及其它蔷薇科果实的分析也具有一定的参考价值。

表7 16个海棠品种果实的感官评价结果Table 7 Sensory evaluation results of 16 cultivars of crabapple fruits

图6 16 个海棠品种果实糖酸组分的聚类分析结果Fig.6 Cluster analysis result of sugar and acid components in 16 cultivars of crabapple fruits

果实的糖酸组分及其含量是构成果实品质的重要因素。不同的糖组分其甜度和口感不同，果糖最甜，蔗糖次之，葡萄糖更次之，但其风味是最好的[23]。赵尊行等[24]对13 个中熟和晚熟苹果品种果实中糖组分的研究结果表明，中晚熟苹果品种果实中的果糖含量最高；王海波等[25]对6 个早熟苹果品种果实中糖分的研究结果表明,所有参试品种果实的糖分中均以果糖含量为最高。而本试验研究结果表明，海棠果实糖组分中以葡萄糖为主，这一差异性可能与果实中各种糖代谢关键酶的活性有关[26-28]，对此尚待进一步研究。王艳颖等[29]在对蔷薇科5 种苹果的研究中发现，苹果中可溶性糖的平均含量为38.018 mg·g-1；刘硕等[30]在对57 份蔷薇科李果实的研究中发现，李果实中可溶性糖的平均含量为74.06 mg·g-1。本研究结果表明，海棠果实的平均糖含量为1.828 mg·g-1，显著低于苹果、李的平均含量。水果中可溶性糖的积累类型包括蔗糖积累型和己糖积累型，研究中发现，16 个海棠品种果实均为己糖积累型，其果糖和葡萄糖含量均显著高于其蔗糖含量，其果糖甜度值显著高于其他糖分，因此，可选择高果糖品种作为亲本杂交选育新品种，如‘东哥’（1.934 mg·g-1）、‘艾琳’（1.703 mg·g-1）、‘萘微利’（1.670 mg·g-1）和‘丽格’（1.540 mg·g-1）等品种。有机酸是存在于果蔬中的一类天然化合物，是影响果蔬风味的一种主要物质，有机酸种类及其含量决定了果蔬的口感与品质[31]；同时，有机酸具有改善消化道活动并增强食欲的作用[32]。有机酸类型可以分为苹果酸积累型、枸橼酸积累型和酒石酸积累型。章秋平[33]和叶丽琴等人[34]分别对蔷薇科杏和李的研究结果表明，杏果实中有机酸的积累类型分为枸橼酸和苹果酸这2 种，其总酸的平均含量为17.10 mg·g-1；李果实中有机酸的积累类型主要为苹果酸积累型，其总酸的平均含量为13.5 mg·g-1。梁俊等[35]在对蔷薇科苹果果实的研究中发现，苹果果实中的酸属于苹果酸积累型，其总酸的平均含量为5.739 mg·g-1。本研究结果表明，16 个海棠品种果实中的酸均属于苹果酸积累型，其总酸的平均含量为10.213 mg·g-1，显著低于杏和李，而高于苹果的平均含量。本研究结果还表明，不同品种海棠果实的有机酸组分间存在差异，‘百夫长’和‘亚当’中未发现酒石酸，而‘赛尔科’‘芭蕾红’‘皇家宝石’和‘凯尔斯’中均未发现柠檬酸，这可能因为受到品种遗传因素的控制，对此有待于结合分子生物学技术进行深入的研究。

多元统计方法中的聚类分析可以从不同角度给予农艺产品全面客观的分析[36]，现已广泛应用于李、桃、杏、柿、苹果仁和枇杷等果实品质的分析之中[2]。刘珩等[11]通过聚类分析将其研究的13 个海棠品种果实划分为3 类；白世践等[37]对吐鲁番地区新征集的葡萄资源果实主要品质性状进行了聚类分析，结果将32 份葡萄资源划分为4 大类。本研究采用聚类分析方法对各个海棠品种果实的食用和综合利用价值进行了分类，这为进一步开发海棠食用价值与品种改良提供了科学依据。但由于条件的制约，本研究仅对海棠种质资源圃中的16 个海棠品种果实进行了分析评价，且仅从果实糖酸组分方面进行了研究，而对于后期果实内部代谢酶及基因差异表达等方面未作研究，今后还需对此开展进一步的探索。

综合分析果实糖酸及甜酸各组分与可溶性固形物含量、维生素C 含量的测定结果和果实感官评价结果可知，‘东哥’‘丽格’和‘萘微利’果实的综合品质及口感均好，果实均偏甜，均可适用于鲜食；‘艾琳’‘黛玉’‘红哨兵’果实的综合品质及口感均较好，果实酸甜，均可适用于加工为果脯等产品；‘珊瑚礁’‘绚丽’‘赛尔科’‘艾琳’‘芭蕾红’‘皇家宝石’‘百夫长’‘约翰东’‘凯尔斯’这类果实的总糖含量均处于较低水平，符合加工型海棠制汁的要求，均可作为制作高档海棠果汁的原料；其余品种海棠果实整体口感均差，不符合食用及加工型海棠的标准，故可用作景观、生态等用途树种。