玉米自交系P178的大斑病抗性QTL定位和效应分析

田志强，艾堂顺，邓　策，尤诗婷，史　芹，马亚龙，李志敏，丁俊强*(.河南农业大学 农学院，河南 郑州 45000； .天津农学院，天津 0080； .郑州农林科学研究所，河南 郑州 450005)

玉米大斑病由大斑刚毛球腔菌(Setosphaeriaturcica,无性型Exserohilumturcicum)引起，是世界上普遍发生、危害严重的一种真菌性病害。玉米植株发病后，叶片先出现水渍状或灰绿色小斑点,随后沿叶脉方向迅速扩大，形成黄褐色或灰褐色梭形大斑，影响植株光合作用，造成籽粒灌浆不足，导致产量降低[1]。在我国玉米主产区，大斑病的常年发生面积约在600万hm2，近年来其在局部地区暴发成灾，对玉米生产造成了严重危害[2-3]。

解决玉米大斑病问题最有效的途径是选育和推广抗病品种，而解析玉米大斑病的抗病遗传机制对抗病育种具有重要的指导作用。自20世纪60年代以来，已经有多个抗大斑病基因(Ht基因)被鉴定，并在玉米生产上得到广泛应用。Hooker[4]最先在美国玉米自交系GE440和秘鲁爆裂玉米品种Ladyfinger中鉴定出抗病基因Ht1。该基因位于玉米第2染色体长臂上，对大斑病病原菌1 号生理小种表现毒性，而对其他生理小种表现出质量性状抗性的特性[5]。相继被鉴定的抗病基因还包括第8染色体长臂上的Ht2[6]和Htn1[7]，以及第7染色体长臂上的Ht3[8]。在20世纪80年代，这些Ht基因通过回交转育的方式被导入到玉米骨干自交系(如A619、B37、B73、Oh43等)中，在玉米生产上发挥了重要的作用[9]。

随着玉米大斑病病原菌生理小种的分化变异，Ht基因在玉米生产上的抗病效应逐渐降低，因此，更多的研究集中到数量性状抗性上[10-11]。采用Tx303×B73组配的连锁群体，Chung等[12]在第1染色体上鉴定到2个主效QTL(qNLB1.02和qNLB1.06)；采用S11×DK888组配的连锁群体，Chung等[13]进一步在第8染色体上鉴定出1个主效QTL(qNLB8.06)，从物理位置分析，该QTL和Ht2比较接近；Poland等[14]利用巢式关联作图群体(包含25个重组自交系群体)对大斑病抗性遗传结构进行了解析，共鉴定出29个QTL，该群体中的大斑病抗性表型变异主要由多个微效QTL的加性效应控制，没有检测到主效抗病位点。

含有热带亚热带血缘的材料在拓宽我国玉米种质基础方面有重要的作用，尤其是良好的抗病性日益受到育种工作者的重视。本研究选用1份含有热带亚热带血缘的优良玉米自交系P178，对其抗玉米大斑病的遗传机制进行分析，鉴定抗病基因位点，为分子标记辅助选择育种和抗病基因分离奠定基础。

1　材料和方法

1.1　供试材料

作图群体是以优良玉米杂交品种农大108的亲本P178为供体亲本，自交系G41为轮回亲本，经过2次回交，4次自交，构建的包含150个家系的BC2F5群体。其中，P178高抗玉米大斑病，G41高感玉米大斑病。

1.2　田间试验设计和抗病性鉴定

2017年夏季分别在大斑病发生和流行的吉林梨树和黑龙江双城种植试验群体，包括150个BC2F5群体家系和亲本。田间试验采用随机区组设计，单行区，行长4 m，行距0.66 m，株距0.25 m，2次重复。玉米乳熟后期在田间调查玉米大斑病发病情况，根据植株叶片的发病面积采用1～9级的标准进行抗性级别划分[15]，其中1级为抗病，9级为感病。对收集的亲本和群体家系表型数据，采用SPSS软件计算平均值和标准差；大斑病抗性在所有环境下总变异按变异来源可分为环境变异和家系间变异，按H2=σg2/(σg2+σgl2/n+σe2/nr)计算广义遗传力，其中，σg2为遗传方差，σe2为误差方差，σgl2为基因型与环境互作的方差，r为每个地点的重复数，n为地点数。

1.3　分子标记连锁图谱的构建和QTL作图

以苗期新鲜叶片为材料，采用CTAB法提取亲本和群体家系总DNA。采用均匀分布于玉米基因组上的852个KASP(Kompetitive allele specific PCR，竞争性等位基因特异性PCR)标记[16]进行群体及亲本间的标记多态性筛选。分子标记连锁图构建采用完备区间作图IciMapping软件[17]，操作步骤如下：用“0”表示抗病亲本P178的纯合带型，“2”表示感病亲本G41的纯合带型，“1”表示杂合带型；对每个标记的带型在群体中的分布进行卡方测验，然后用“group”命令(LOD=3.0)对所有的标记进行分组，之后分别对每组标记用“order”命令进行自动排序，最后用“ripple”命令确定每一条染色体上所有标记的最佳排列顺序。采用完备区间作图软件IciMapping中的加性效应模型(ICIM-ADD)对群体的加性效应进行评估，采用上位性效应模型(ICIM-EPI)鉴定上位性效应并判定其显著性。

2　结果与分析

2.1　玉米遗传连锁图谱的构建

在852个KASP标记中，有349个标记在亲本间表现出多态性。利用多态性标记对群体家系基因型进行了检测，并利用完备区间作图IciMapping软件进行遗传连锁图谱构建。采用LOD>3.0标准，将349个标记分成10个连锁群，覆盖玉米10条染色体，图谱总长度2 336.2 cM，平均间距为6.89 cM。其中，第4染色体上含有的标记数目最多，有53个；第10染色体上包括的标记数目最少，有14个；第7染色体上标记间的遗传距离最小，为5.52 cM；而第10染色体上标记间的遗传距离最大，为10.45 cM。分子标记遗传连锁图谱的构建为下一步的抗病基因定位奠定了基础。

2.2　玉米亲本和作图群体的大斑病抗性表型分析

在玉米乳熟后期，调查玉米大斑病发病情况，对亲本和作图群体家系的大斑病抗性进行评估。在吉林梨树和黑龙江双城，玉米大斑病抗性在2个亲本和群体家系间呈现广泛的变异(表1)。P178表现为高抗玉米大斑病；G41表现为高感玉米大斑病。在吉林梨树和黑龙江双城，P178的抗性级别分别为2.5和2.8，而G41的抗性级别分别是7.1和7.5，亲本间高度差异化的抗性表现为研究抗病基因的分离遗传规律奠定了基础。

与2个亲本的抗性表现相比，作图群体家系在吉林梨树和黑龙江双城的平均抗性级别分别为4.6和4.9。方差分析结果表明，吉林梨树和黑龙江双城玉米大斑病抗性的遗传力分别为0.96和0.97，综合两点分析，遗传力为0.94。作图群体家系间广泛的抗性遗传变异源自2个亲本的抗性差异，其较高的遗传力也表明大多数的抗性遗传变异由抗性因子控制。

表1　玉米亲本和作图群体大斑病抗性级别和遗传力

注：**表示在P<0.01水平显著。

2.3　玉米大斑病抗性QTL定位及基因效应分析

根据吉林梨树和黑龙江双城的玉米大斑病抗性鉴定结果，利用完备区间作图软件对抗病QTL的位置和效应分别进行了分析(图1、表2)。在梨树点，共检测到4个QTL与玉米大斑病抗性显著相关，分别位于第1(bin1.04)、2(bin2.09)、8(bin8.06)、9(bin9.03)染色体上。在检测到的4个QTL中，位于第9染色体上的QTL有最大的效应值，其加性效应为0.62，可解释抗性23%的表型遗传变异；另一个效应较大的QTL位于第2染色体上，其加性效应为0.55，可解释抗性20%的表型遗传变异;其余2个抗性QTL对大斑病抗性变异的贡献率较小，第8染色体上的QTL可以解释13%的表型遗传变异，而位于第1染色体上的QTL 解释8%的表型遗传变异。所有的抗性位点都来自于抗病亲本P178，没有检测到来自亲本G41的抗性位点。在双城点，也检测到4个QTL与玉米大斑病抗性显著相关，分别位于第1(bin1.04)、2(bin2.09)、8(bin8.01、8.06)染色体上，在第8染色体上检测到的2个QTL中，其中一个QTL有较大的效应值，其加性效应为0.93，可解释10%的抗性表型遗传变异；位于第1和第 2染色体上的QTL，均可以解释9%的表型遗传变异；而位于第8染色体上的另一个QTL解释4%的表型遗传变异。所有的QTL抗性位点都来自于抗病亲本P178，没有检测到来自亲本G41的抗性位点。

图1　玉米自交系P178×G41构建的BC2F5群体中检测到的大斑病抗性QTL

表2　利用完备区间作图软件鉴定的玉米大斑病抗性QTL

注：QTL区间为双侧标记；R2表示QTL解释的遗传变异；Add正值表示抗病位点来自P178。

3　结论与讨论

本研究采用QTL作图策略，对玉米自交系P178的大斑病抗性进行了QTL定位。在玉米第1、2、8、9染色体上共检测到6个抗病QTL，分别可以解释4%～23%的表型遗传变异，其中在第2和第8染色体上检测到2个稳定的抗病QTL。

玉米大斑病是一种复杂的真菌性病害，选择合适的作图群体进行抗病性鉴定，是进行QTL定位的基础。本研究在作图群体选择上，选用感病亲本作为轮回亲本，抗病亲本为供体亲本，通过1次杂交、2次回交和4次自交发展的BC2F5群体作为定位群体。与传统的作图群体(如重组自交系群体)比较，本研究采用的群体在抗病性鉴定方面有明显的优点，主要表现在群体的开花期变异小，尽量减少了开花期性状对病原菌侵染和表型鉴定的干扰，保证了表型数据采集的可靠性和一致性，为后续的QTL定位奠定了良好的基础。

在玉米基因组中，已经有多个抗大斑病位点被报道。分析这些抗病位点在基因组上的分布，发现存在抗病热点区域。在这些热点区域中，部分抗病位点已经被精细定位，或者分离出了抗病基因。如在第1染色体上，存在2个抗病热点区域(qNLB1.02和qNLB1.06)，进一步分析表明，编码植物抗病相关蛋白remorin的基因(ZmREM6.3)[18]和一个编码类受体激酶的基因(pan1)[19]，分别是qNLB1.02和qNLB1.06的候选基因。在玉米第8染色体(bin 8.06)上，Hurni等[20]克隆了大斑病抗病基因Htn1，该基因编码一个与细胞壁受体相关的蛋白激酶，可以感受玉米大斑病病原菌或者寄主产生的激发子，从而激发下游的抗病信号产生免疫应答反应。本研究鉴定了6个抗大斑病QTL位点，与前人的研究相比较，除发现了一致的抗病位点，同时也鉴定出了新的抗病位点。在梨树和双城2个地点，在玉米第8染色体(bin8.06)上检测到一个稳定的QTL位点，位于标记PZE-108095253和PZE-108090837之间，该区间与Htn1所在的区间相重叠。此外，本研究还在第2染色体上检测到稳定的抗病位点。在单个环境下，玉米第1染色体(bin1.04)、第8染色体(bin8.01)、第9染色体(bin9.03)上也检测到抗病位点。这些抗病位点与已经报道的抗病热点区域不同，可以认为是新的抗大斑病位点。

分子标记辅助选择育种是玉米性状改良的重要技术手段，和常规育种技术相结合，可以大大加快玉米新品种选育的进程。为了使抗病位点尽快地运用到抗病实践中，基因定位时可使用与育种直接有关的材料，以缩短基因定位研究与育种应用的距离。本研究在抗病材料选择上，抗源来自生产上大面积应用的杂交种农大108的亲本P178。P178含有热带种质血缘，具有配合力高、综合农艺性状优良、抗逆性好的特点，在玉米育种实践中也被广泛用作抗病性改良的供体材料[21]。本研究鉴定了与抗病位点连锁的分子标记，为大斑病抗病分子标记辅助选择育种和选育综合农艺性状优良的抗病种质奠定了基础。

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