HPLC法测定红羚清散中西红花苷I和西红花苷II的含量

★袁娟丽 刘明智 张钰祺（萍乡市食品药品检验所 江西　萍乡　337000）

红羚清散是萍乡市中医院应用多年的纯中药制剂，是依据仲景《伤寒论》六经辨证理论衍化而来，具有平肝祛风，清热镇惊，解毒的作用。主要用于热盛、神昏，谵语发狂，惊痫抽搐，目赤头痛等症。红羚清散主要由羚羊角、西红花2味中药组成。目前，红羚清散的现行质量标准为《江西省食品药品监督管理局医疗机构制剂》GZJ-0289-（1）-2006，检验项目包括“性状”“鉴别”“检查”等，暂无含量测定项。为进一步保证该制剂的临床疗效，有效控制其质量，提高其质量标准，本实验选取红羚清散中西红花的主成分西红花苷I和西红花苷II为定量指标，采用高效液相色谱法，对其进行含量测定方法的研究。

1　仪器与试药

高效液相色谱仪（Agilent 1200四元低压梯度泵系列，Agilent1200化学工作站，DAD检测器）；西红花苷I对照品（Stanford Chemicals，批号：PR151116-08，含量以98.52%计），西红花苷II对照品（Stanford Chemicals，批号：PR160225-17，含量以98.61%计）。水为超纯水，甲醇为色谱纯，其它试剂均为分析纯。实验用样品由萍乡市中医院提供。

2　方法与结果

2.1色谱条件 Agilent 5 TC-C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm），流动相：甲醇-水（49∶51），检测波长为440nm；流速：1.0mL/min；柱温为35℃；进样量为10μL。理论板数按西红花苷I峰计算均应不低于3500。

2.2溶液制备

2.2.1对照品溶液的制备 取西红花苷I对照品、西红花苷II对照品适量，精密称定，分别加稀乙醇制成每1mL含20µg和5µg的溶液，即得。

2.2.2供试品溶液的制备 取本品约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇10mL，称定重量，冰浴超声处理（功率500W，频率40KHz）20min，放冷，称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3方法学考察

2.3.1系统适用性实验 取对照品溶液、供试品溶液及空白溶剂，按2.1项下色谱条件测定，比较供试品溶液色谱、混合对照品色谱及空白溶剂色谱，结果供试品中西红花苷I和西红花苷II色谱峰有较好的色谱分离，见图1。

2.3.2线性关系考察 精密称取西红花苷I对照品9.93mg，置50mL量瓶中，加稀乙醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为西红花苷I对照品母液；取母液逐级稀释成4.8915，9.7830，19.5661，23.4793，39.1321µg/mL的溶液，精密吸取上述对照品溶液及西红花苷I对照品母液10μL注入液相色谱仪，以峰面积积分值为纵坐标，对照品浓度为横坐标，绘制标准曲线，求得回归方程为Y=58.91X-4.1531，r=0.9999，结果西红花苷I在4.8915～195.6607µg/mL之间呈良好线性关系。

另精密称取西红花苷II对照品9.82mg，置50mL量瓶中，加稀乙醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为西红花苷II对照品母液。取母液逐级稀释成0.9684，1.9367，3.8734，7.7468，19.3670µg/mL的溶液，精密吸取上述对照品溶液及西红花苷II对照品母液10μL注入液相色谱仪，以峰面积积分值为纵坐标，对照品浓度为横坐标，绘制标准曲线，求得回归方程为Y=73.687X-3.0682，r=0.99981，结果西红花苷II在0.9684～193.6700µg/mL之间呈良好线性关系。

图1　高效液相色谱图

2.3.3精密度试验 精密吸取混合对照品（西红花苷I对照品溶液19.5661µg/mL、西红花苷II对照品溶液3.8734µg/mL），按2.1项下色谱条件，重复进样6次，结果西红花苷I峰面积RSD为1.70%；西红花苷II峰面积RSD为2.89%。表明精密度良好。

2.3.4重复性试验 取同批样品（批号20151106），照2.3项下平行制备供试品溶液6份，照2.1项下色谱条件测定。结果西红花苷IRSD为2.34%；西红花苷IIRSD为1.80%，表明此方法的重复性良好。

2.3.5加样回收试验 精密称取已知含量的本品（批号20151106）约0.25g，置具塞锥形瓶中，精密添加混合对照品溶液（西红花苷I对照品：19.6449µg/mL，西红花苷II对照品：4.4769µg/mL）10mL，按2.1项下方法试验，计算回收率，结果见表1-2。

表1　西红花苷I回收率试验结果（n=6）

表2　西红花苷II回收率试验结果（n=6）

2.3.6稳定性 精密吸取供试品溶液（批号20151106），分别在0、2、4、6、8、12h进样，按2.1项下色谱条件记录西红花苷I和西红花苷II的峰面积，结果供试品溶液中西红花苷I和西红花苷II在12h内峰面积无明显变化，西红花苷I RSD为0.79%（n=6），西红花苷II RSD为0.1.34%（n=6），表明样品溶液在12h内稳定。

2.3.7样品测定 取本品5批，照2.1项下方法试验，测定结果见表3。

表3　样品测定结果（n=5）　mg/g

3　讨论

3.1色谱条件的选择 参考中国药典［1］及有关文献［3］，选择440nm作为检测波长，甲醇-水（49∶51）为流动相，在此条件下，各组分的峰型及分离效果良好，同时未见其他成分干扰。

3.2供试品溶液的制备 参考中国药典［1］，采用超声提取法，以稀乙醇为提取溶剂。分别对10min、20min、30min提取时间进行比较，结果表明20min已提取完全。同时，因西红花苷稳定性差，且对温度非常敏感［10］，分别对供试品在冰浴中和常温下超声处理方法进行了对比研究。结果表明，冰浴比常温提取所测得的西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ含量略高，故采用冰浴超声提取作为红羚清散中西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ的提取方法。此外，考察了避光条件下与未避光条件下操作，最后确定供试品溶液制备应避光操作，并置于棕色瓶中避光保存。

根据实验结果可知，不同批次样品中西红花苷I与西红花苷II含量差异显著，提示西红花原药材的质量存在差别，为避免由原药材引起中成药的疗效差异，有必要对西红花进行质量控制。本研究建立了同时测定红羚清散中西红花苷I与西红花苷II含量的HPLC方法，经方法学验证，该方法准确、快速，操作简便，专属性强，重现性好，可用于红羚清散的质量控制。

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