辽宁省2016～2017年甲型H3N2亚型流感病毒耐药性分析

孙海波 刘双 宋亦春 王璐璐 孙佰红 毛玲玲 孙英伟

【摘要】 目的 分析辽宁省2016～2017流感年度H3N2亚型流感病毒M2蛋白和神经氨酸酶（NA）基因特点， 了解并掌握该年度省内流感毒株对烷胺类药物及NA抑制剂类药物的耐药情况， 为流感的治疗及防控提供科学依据。方法 选取辽宁省内各市流感样病例， 经病毒分离获得的甲型H3N2亚型流感毒株55株， 对M2基因及NA基因进行扩增并测序后对耐药位点进行分析。结果 2016年4月～2017年3月， 辽宁省共采集流感样病例标本13956份， 分离流感毒株1528株。其中甲型流感毒株835株， H3N2亚型毒株378株， 约占甲型流感毒株的45.3%。测序获得55株H3N2亚型流感毒株的M2基因片段（第572～1027核酸位点和NA基因片段（第1～914位核苷酸位点）核苷酸序列。经比对分析， 全部检出S31N突变， 对烷胺类药物均表现为耐药。此外， 所有毒株的第51位均发生了异亮氨酸到缬氨酸的突变。NA基因耐药位点均未检出突变， 未发现NA抑制剂类药物的耐药株。结论 辽宁省2016～2017年流行的甲型H3N2亚型流感病毒普遍对烷胺类药物耐药， 未发现NA抑制剂类药物的耐药株。因此， 奥司他韦等NA抑制剂类药物是治疗H3N2型流感的敏感药物。但在实际工作中仍应对耐药性进行监测， 实时关注耐药株的产生。

【关键词】 甲型H3N2亚型流感；耐药性分析；烷胺类药物；神经氨酸酶抑制剂

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2018.09.117

流感病毒是引起流行性感冒的病原体， 常在北方冬春季引起暴发或流行。全球监测数据显示， 在季节性流感病毒中， 甲型H3N2亚型流感病毒能够引起人群更为严重的呼吸道症状[1， 2]。2016～2017年辽宁省流感流行呈现甲型H1N1和H3N2亚型共流行的情况。甲型H3N2流感病毒与新甲型H1N1流感病毒所导致的疾病负担相似[3]， 因而应时刻关注H3N2亚型流感病毒的流行情况及耐药情况。目前， 流感疫苗是用于流感预防的最佳手段。但由于人群接种率低， 抗病毒药物依然是治疗和预防流感的主要措施。现阶段国内常用的抗流感病毒药物主要有M2蛋白抑制剂和NA抑制剂两大类。经过多年耐药监测发现， 流感病毒对烷胺类药物耐药比例不断升高， 至今几乎全部耐药；NA抑制剂类药物的耐药株也呈增加趋势， 因此， 流感毒株耐药监测工作对流感的治疗及预防具有十分重要的意义。本研究对2016～2017年辽宁省甲型H3N2亚型流感病毒的耐药情况进行分析， 为流感防治工作奠定基础。现报告如下。

1 材料与方法

1. 1 标本来源 采集2016年4月～2017年3月辽宁省各国家级监测哨点医院流感样病例标本。

1. 2 病毒分离 采用狗肾细胞（MDCK）进行病毒分离。细胞病变后使用红细胞凝集方法进行试验， 滴度>1∶8的毒株用红细胞凝集抑制试验进行分型（试剂由国家流感中心提供）。研究所用毒株均经过国家流感中心复核鉴定。

1. 3 毒株选择 选取55株不同地区国家级哨点医院采集的流感样病例标本分离得到的甲型H3N2亚型流感毒株。

1. 4 核酸提取 使用EZ1 Virus Mini Kit V2.0（cat.No.955134）试剂盒进行核酸提取， 提取量60 μl。核酸提取后立即使用或置于-70℃冻存。

1. 5 聚合酶链式反应（PCR）检测 M2基因引物序列[4]为MF：5‘-CAGGTAGATATTGAAAGAT-3；MR：5-GTAGAAACAAGGTAGTTTT-3；NA基因引物序列[5]为NaF：5‘-GCAAAAGCAGGAGTGAAAR-3；NaR：5-ATATCTACTATGGGCCTATTGGA-3。以上引物均由invitrogen公司合成。

1. 6 逆转录（RT）-PCR反应 扩增毒株的M2基因和NA基因。采用Qiagen one-step PCR kit进行扩增。反应条件：50℃反转录30 min；95℃灭活反转录酶15 min；94℃ 30 s， 55℃ 60 s， 72℃ 60 s共40个循环；72℃ 10 min延伸；4℃保持。反应设置阴阳性对照。扩增产物通过2%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1. 7 核酸测序 PCR扩增产物送invitrogen公司进行核苷酸双向测序。

1. 8 序列分析 采用Bioedit、DNAstar和Mega6.0分析软件对M2基因和NA基因序列分析和氨基酸序列的同源性分析。通过耐药的分子标記鉴定耐药株。据报道， 与M2基因耐药有关的分子标记有L26F、V27A、A30T、S31N和G34E[6]。与NA基因耐药有关的分子标记有E119V、Q136K、D151A、I222V、H274Y、R292K和N294S[7]。只要上述位点中有任意位点发生突变， 病毒即产生耐药性。

2 结果

2. 1 病毒流行情况 2016年4月～2017年3月辽宁省共采集流感样病例标本13956份， 分离流感毒株1528株。其中甲型流感毒株835株， H3N2亚型毒株378株， 约占甲型流感毒株的45.3%。

2. 2 耐药位点分析 测序获得55株H3N2亚型流感毒株的M2基因片段（第572～1027核酸位点和NA基因片段（第1～914位核苷酸位点）核苷酸序列。经比对分析， 全部检出S31N突变， 对烷胺类药物均表现为耐药。此外， 所有毒株的第51位均发生了异亮氨酸到缬氨酸的突变。NA基因耐药位点均未检出突变， 未发现NA抑制剂类药物的耐药株。耐药位点检出情况。见表1。

3 讨论

流行性感冒是主要的呼吸道传染病之一， 多发于冬春季节。由于流感疫苗相对于流感的流行存在滞后现象， 因此抗病毒药物成为治疗流感的重要手段[8]。研究表明， 流感患者在发病初期48 h内进行抗病毒治疗能够有效的缩短病程及发热时间[9]， 对于流感的治疗具有十分重要的意义。

流感病毒的抗病毒药物包括烷胺类药物和NA抑制剂类两类。烷胺类药物最早于1966年被美国FDA批准用于甲型流感的治疗， 因疗效顯著且价格合理而被广泛使用， 随之而来的是烷胺类药物耐药性逐年增加， 至2005年底我国该类药物的耐药率已经达到100%。但也有研究证实， 由于流感病毒极易发生重组引起突变， 导致耐药率有所降低， 如加拿大耐药率曾由100%下降到了30.1%。因此， 甲型流感病毒烷胺类药物耐药监测仍具有重要意义。NA抑制剂类药物在我国流感治疗中的应用也日渐广泛。目前临床上被批准使用的NA抑制剂类药物有扎那米韦和磷酸奥司他韦两种， 奥司他韦（达菲）已经成为预防和治疗流感的主要制剂。近年来， NA抑制剂类药物的敏感株不断出现， 如1例H7N9患者检测到NA序列中携带K294R突变位点并引起耐药[10]。由此推测， NA抑制剂的使用可能导致耐药株的出现。研究发现， NA基因第274位和294位突变能够导致对奥司他韦和帕拉米韦耐药， 第152位导致对扎那米韦耐药， 第119位突变导致对奥司他韦和扎那米韦耐药[11]。此外， I222V可以引起中等强度的耐药， 与E119V突变协同作用能提高H3N2亚型流感病毒对奥司他韦的耐药水平[12]。

本研究显示， 2016～2017年辽宁省流行的流感病毒以甲型为主， 其中H3N2亚型占45.3%。并且， 近年来持续有H3N2亚型流感病毒流行。经氨基酸序列比对分析发现， 所选的55株流感毒株均对烷胺类药物耐药， 对NA抑制剂类药物敏感。据统计， 近年来甲型流感病毒普遍对烷胺类药物耐药， 因此烷胺类药物在近期流感的抗病毒治疗中意义不大， 临床治疗推荐使用NA抑制剂类药物。但由于流感病毒不断变异， 仍然可能有烷胺类药物敏感株的出现甚至流行， 因此仍有继续监测的意义和必要。NA抑制剂类药物在临床的广泛应用， 导致近年来不断出现NA抑制剂的流感及禽流感耐药株。本次研究所选毒株中尚未发现NA基因耐药位点发生变异， 但由于NA抑制剂类药物在临床治疗中的重要性， 应持续开展长期的监测， 以期发现有意义的变异， 及时有效的指导临床用药， 为流感防控提供数据依据及技术支持。

参考文献

[1] Barr IG， McCauley J， Cox N， et al. Epidemiological， antigenic and genetic characteristics of seasonal influenza A（H1N1）， A（H3N2） and B influenza virus： basis for the WHO recommendation on the composite on of influenza vaccines for use in the 2009-2010 Northern Hemisphere season. Vaccine， 2010， 28（5）： 1156-1167.

[2] 周妍， 李月芳， 陈健， 等. 2009-2012年上海地区儿童甲型H3N2流感病毒的耐药监测. 中国卫生检验杂志， 2014（11）：153- 156.

[3] Esposito S， Molteni CG， Daleno C， et al. Impact of pandemic A/H1N1/2009 influenza on children and their families： Comparison with seasonal A/H1N1 and A/H3N2 influenza virus. J Infect， 2011， 63（4）： 300-307.

[4] Lan Y， Li Z， Dong L B， et al. Adamantane resistance among influenza A （H3N2） viruses isolated from the mainland of China. Chinese Journal of Experimental & Clinical Virology， 2006， 20（2）：21-23.

[5] Laplante JM， Marshall SA， Shudt M， et al. Influenza antiviral resistance testing in New York and Wisconsin， 2006 to 2008： methodology and surveillance data. J Clin Microbiol， 2009， 47（5）： 1372-1378.

[6] Hay AJ， Zambon MC， Wolstenholme AJ， et al. Molecular basis of resistance of influenza A virus to amantadine. J Antimicrob Chemother， 1986， 18（Suppl B）：19-29.

[7] Samson M， Pizzorno A， Abed Y， et al. Influenza virus resistance to neuraminidase inhibitors. Antiviral Res， 2013， 98（2）：174-185.

[8] 熊英， 龚甜， 李健雄， 等. 江西省季节性A（H1N1）流感病毒的基因特点及耐药性分析. 中国卫生检验杂志， 2015， 25（2）：153- 156.

[9] Reuman PD， Bernstein DI， Keefer MC， et al. Efficacy and safety of low dosage amantadine hydrochloride as prophylaxis for influenza A. Antiviral Research， 1989， 11（1）：27.

[10] Bright RA， Medina MJ， Xu X， et al. Incidence of adamantane resistance among influenza A（H3N2） viruses isolated worldwide from 1994 to 2005： a cause for concern. Lancet， 2005， 366（9492）： 1175-1181.

[11] Gao R， Cao B， Hu Y， et al. Human infection with a novel avian-origin influenza A（H7N9） virus. N Eng J Med， 2013， 368（20）： 1888-1897.

[12] Ledesma J， Vicente D， Pozo F， et al. Oseltamivir-resistant influenza a（H1N1） 2009 viruses in Spain. Clin Virol， 2011， 51（3）：205-208.

[收稿日期：2017-12-08]