超敏荧光定量PCR法核酸检测与乙肝两对半联用在乙肝防控中的临床应用

陈建仁 李驰 关惠恒

【摘要】 目的 探讨超敏荧光定量聚合酶链反应（PCR）法核酸检测与乙型肝炎（乙肝）两对半联用在乙肝防控中的臨床应用。方法 155例乙肝患者分别采集血清样本， 利用化学发光法和基于磁珠法自动化核酸提取的超敏荧光定量PCR法分别进行乙肝两对半和乙肝病毒脱氧核糖核酸（HBV-DNA）检测。结果 155例样本中乙肝两对半共检出12种血清类型， 其中小三阳占58.06%， 大三阳占20.00%。155例样本超敏荧光定量PCR总阳性率为62.58%， 检测下限低至10 IU/ml， 其中小三阳阳性率为66.67%， HBV-DNA平均含量（6.17±0.91）lgIU/ml；大三阳阳性率为90.32%， HBV-DNA平均含量（6.98±1.02）lgIU/ml。小三阳和大三阳组超敏荧光定量PCR阳性率及HBV-DNA平均含量比较差异均有统计学意义（P<0.05）。结论 基于磁珠法自动化核酸提取的超敏荧光定量PCR法可准确测定病毒载量， 检测下限低至10 IU/ml， 与传统乙肝两对半联用有助于乙肝的临床诊断、用药指导及疗效监测。

【关键词】 乙型肝炎病毒；磁珠法；核酸提取；超敏；荧光定量；聚合酶链反应

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2018.09.049

乙肝病毒（hepatitis B virus， HBV）是一种嗜肝DNA病毒， 可引起急性肝炎、慢性肝炎、重症肝炎等， 部分患者可演变成肝硬化或肝癌。乙肝已成为世界性公共卫生问题， 我国为乙肝高发区， 人群表面抗原携带率高达7.18%， 慢性乙肝患者约2000万[1]。乙肝流行形势严峻， 及时并准确检测HBV对防控乙肝尤为重要。目前临床多采用免疫学方法检测HBV血清标志物， 包括乙肝表面抗原（HBsAg）、乙型肝炎表面抗体（HBsAb）、乙肝e抗原（HBeAg）、乙肝e抗体（HBeAb）和乙肝核心抗体（HBcAb）， 即乙肝五项或乙肝两对半， 可反映机体感染后的免疫状态， 但不能直接反映病毒在体内的复制状况， 且对空窗期或者隐匿性乙肝患者易漏检[2]。随着分子诊断技术的进步， HBV-DNA检测技术应运而生， HBV-DNA含量是HBV复制最直接、最可靠的检测指标， 在及时诊断、疗效评价与预后判定方面发挥着重要作用[3]。本研究分别采用化学发光法和超敏荧光定量PCR法对155例乙肝患者的乙肝两对半及HBV-DNA进行检测， 以期阐明二者联用在乙肝防控中的临床应用价值。现报告如下。

1 资料与方法

1. 1 一般资料 选取2016年7～9月阳江市公共卫生医院就诊的155例乙肝患者， 男112例， 女43例， 男女比例约为2.60∶1；年龄14～81 岁， 平均年龄42.17岁。

1. 2 试剂 乙肝五项检测试剂盒（化学发光法）购自深圳市新产业生物医学工程有限公司；Ex-DNA/RNA病毒核酸提取试剂盒（64 T/盒， 预封装）及HBV核酸定量检测试剂盒（荧光PCR法）（32 T/盒）均购自西安天隆科技有限公司。

1. 3 设备 全自动化学发光仪（MAGLUMI 2000 Plus）购自深圳市新产业生物医学工程有限公司；磁珠法自动核酸提取仪（NP968-C）购自西安天隆科技有限公司；荧光定量PCR仪（LightCycler480）购自美国罗氏公司。

1. 4 方法 分别按照相应要求各采集5 ml静脉血， 于3 h 内分离血清， 低温保存待检。

1. 4. 1 乙肝五项检测 采用化学发光法检测乙肝五项， 即HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb。具体操作按照说明书严格执行， 根据相应标准判定阴阳性。

1. 4. 2 HBV-DNA检测

1. 4. 2. 1 磁珠法自动化核酸提取 采用磁珠法自动核酸提取系统提取血清样本的HBV-DNA， 按照说明书进行操作， 将核酸产物低温保存备用。

1. 4. 2. 2 超敏荧光定量PCR法检测 利用超敏荧光定量PCR法定量检测低温保存的核酸产物， 按照说明书进行操作， 根据定量结果判定阴阳性。

1. 5 统计学方法 采用SPSS19.0统计学软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验；计数资料以率（%）表示， 采用χ2检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

155例样本中乙肝两对半共检出12种血清类型， 其中小三阳占58.06%， 大三阳占20.00%。155例样本超敏荧光定量PCR总阳性率为62.58%（97/155）， 检测下限低至10 IU/ml， 其中小三阳阳性率为66.67%， HBV-DNA平均含量（6.17±0.91）lgIU/ml；大三阳阳性率为90.32%， HBV-DNA平均含量（6.98±1.02）lgIU/ml。小三阳和大三阳组超敏荧光定量PCR阳性率及HBV-DNA平均含量比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1。

3 讨论

乙肝两对半是临床上常用检测HBV的方法， 目前国家食品药品监督管理总局（CFDA）批准的这类方法有胶体金、酶联免疫法、化学发光法等。此类方法快速、简便、成本低， 但灵敏度低、特异性差。对低病毒载量的空窗期或者隐匿性乙肝患者容易漏检， 且不能直接反映体内病毒的复制状况 [2]。近年荧光定量PCR、基因芯片和PCR反向点杂交等分子生物学方法不断涌现， 其灵敏度高、特异性好， 很好地解决免疫学方法的缺陷， 降低漏检率[3， 4]。其中， 荧光定量PCR法因其具有更高的灵敏度， 且可对病毒进行精确定量、操作简便等优势， 在临床上应用最为广泛[5]。

HBV病毒载量能反映乙肝患者体内HBV复制情况和感染性的强弱， 为患者治疗方案的选择和疗效评价、治療终点判断、耐药和复发监测提供客观依据。传统乙肝治疗中， 常以HBV-DNA<2000 IU/ml作为应答的标准之一， 但终止治疗后常会出现病毒反跳的状况。研究表明主要是因为低载量的HBV未被监测到， 导致病毒持续在体内复制。准确而敏感地监测患者体内HBV-DNA载量的动态变化对治疗方案的选择和疗效评价至关重要[6-8]。

经CFDA网站查询， 目前通过审批的大部分HBV-DNA检测产品的前期核酸提取多采用手工煮沸法， 不能自动化， 费时费力， 据报道回收率低， 重复性差， 灵敏度仅为500～1000 IU/ml[6， 9-11]。本研究采用超敏荧光定量PCR检测试剂， 前期核酸提取采用全自动磁珠法核酸提取系统， 通过裂解病毒使DNA充分游离出来， 再利用表面特殊处理的磁珠吸附DNA， 而蛋白质、多糖及脂类等杂质留在溶液中， 在磁场作用下磁性颗粒与液体分开， 再经洗脱得到病毒DNA。磁珠法核酸提取大大提高核酸的纯度和得率， 由于采用自动化提取， 重复性也更好， 交叉污染率更低， 后期荧光PCR的灵敏度高达10 IU/ml， 可以更好地指导临床诊断、用药及预后[10]。

乙肝两对半主要反映机体对HBV的免疫状态， 可间接反映HBV的传染性及病情严重程度。临床研究表明， 大三阳患者传染性很强[8]， 超敏荧光定量PCR结果也印证这一点。本研究中大三阳患者荧光PCR阳性率及平均病毒载量均为各组最高， 分别为90.32%和（6.98±1.02）lgIU/ml与小三阳比较， 差异均有统计学意义（P<0.05）。与王华、谭斌等[12， 13]研究一致。既往临床认为小三阳患者传染性较弱， 此次研究表明小三阳HBV-DNA含量高达（6.17±0.91）lgIU/ml仅次于大三阳， 与谭斌等[13]的研究一致， 小三阳病毒载量已超过临床抗病毒的应答标准2000 IU/ml， 具有较强的传染性， 应及时治疗[14]。（HBsAg+HBsAb+）， （HBsAg+HBcAb+）， （HBsAg+HBsAb+HBeAb+HBcAb+）及（HBsAg+HBsAb+HBeAg+HBcAb+）四种血清型患者的HBV-DNA也为阳性， 有一定的传染性， 应该引起重视， 国内王华、张庆安等[12， 15]研究也对此做相应报道。在本研究中， 部分血清学阳性的患者超敏荧光定量PCR检测却显示为阴性， 分析原因可能如下：①部分患者用药治疗后， HBV-DNA先于血清标志物消失；②HBV整合进宿主肝细胞， 导致血清中无法检测到游离HBV-DNA[8]。

综上所述， 基于磁珠法自动化核酸提取的超敏荧光定量PCR法较传统核酸检测方法， 灵敏度更高， 前期样本处理还可全自动化。传统免疫学方法又可直接反映机体对HBV的免疫状态， 且成本和实验室条件要求都低。超敏荧光定量PCR法和免疫学方法联合使用可在HBV的及时诊断、用药选择、疗效评估及病程预测等方面发挥巨大的临床价值。

参考文献

[1] 胡晓丽， 赵宏伟， 吴晓岩， 等. 乙型肝炎病毒感染的流行现状. 临床肝胆病杂志， 2012， 28（6）：413-416.

[2] 吴丽君. 对临床检测HBV-DNA筛查隐匿性HBV携带者的探讨. 中外医学研究， 2015（13）：62-63.

[3] 刘兵， 胡蓉， 杨联云， 等. 乙型肝炎病毒DNA定量分析的临床意义. 中国医药导刊， 2012， 14（4）：673-674.

[4] 鲍淑华， 楼正青， 高丽华. 乙肝病毒标记物阳性表型血清标本HBV-DNA水平分析. 中华全科医学， 2014， 12（6）：977-978.

[5] 刘青鹤. HBV-M与定量PCR法检测HBV-DNA相关性探析. 中国医学创新， 2014（25）：123-124.

[6] 黄丽珍. 肝组织HBV DNA检测对血清HBV DNA阴性乙型肝炎肝硬化患者抗病毒治疗的指导意义. 吉林大学， 2013.

[7] 中华医学会肝病学分会. 慢性乙型肝炎防治指南（2015年版）. 中国肝脏病杂志（电子版）， 2016， 19（3）：1-18.

[8] Organization WH. Guidelines for the Prevention， Care and Treatment of Persons with Chronic Hepatitis B Infection. World Health Organization， 2015.

[9] 倪俊明， 孙梅， 吴旭平. 国产荧光定量PCR与COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan v 2. 0检测HBV DNA结果比较. 临床检验杂志， 2014， 32（5）：398-399.

[10] 戎国栋， 徐婷， 赵鸿， 等. 超敏HBV DNA定量检测系统的临床应用研究. 临床与病理杂志， 2015， 35（8）：1537-1541.

[11] 姜红飞， 曹俊敏. 基于磁珠法的荧光定量PCR检测HBV-DNA临床应用评价. 中国微生态学杂志， 2015， 27（5）：610-612.

[12] 王华. FQ-PCR技术定量检测HBV-DNA与乙型肝炎病毒免疫学标记物的相关性. 中国现代药物应用， 2016， 10（3）：19-20.

[13] 谭斌， 杨文才， 李嘉， 等. HBV-DNA水平与乙型肝炎两对半模式的相关性. 中国老年学， 2015（10）：2749-2750.

[14] 颜敏. 血清HBV-DNA荧光定量PCR检测与乙肝病毒标志物模式的相关因素探讨. 中外医疗， 2014（26）：193-194.

[15] 张庆安. 乙肝患者血清免疫学标志物检测结果与HBV—DNA定性、定量关系的分析. 山东医药， 2012， 52（22）：74-76.

[收稿日期：2018-01-22]