会仙湿地底泥可培养微生物*

阮楚晋，潘丽霏，刘洁，刘祎，肖咪云，陆祖军,2,3

(1.广西师范大学生命科学学院，广西 桂林541004；2.珍稀濒危动植物生态与环境保护省部共建教育部重点实验室，广西 桂林541004；3.广西高校野生动植物生态学重点实验室，广西 桂林541004)

湿地具保持水源、净化水质、蓄洪抗旱、维护生物多样性等重要的环境调节功能和生态效益，也蕴含丰富的微生物资源[1]。广西会仙湿地是中国最大的岩溶湿地之一，其地貌独特，是广西热带、亚热带岩溶峰林地貌最大、最有研究价值的典型湿地。由于人类活动的增加，农药的滥用和生活污水的随意排放，导致该湿地富营养化和污染加剧[2-3]。蓝运华、江绍峰等[4-5]研究表明农药百草枯质量分数高于120 μg/g抑制会仙湿地底泥微生物代谢活性，并通过测定在百草枯作用下22 ℃时会仙湿地微生物生长周期各个阶段的代谢热发现出现2个产热指数期，表明同一群落微生物改变了体内一些重要酶的转录和表达。余丽娟等[6]研究该湿地的细菌菌落总数、大肠菌群数和粪大肠菌群数的季节变化动态，表明夏季较其他三季相比在以上3个方面均有明显增长趋势。但尚未见对该湿地底泥微生物多样性的报导，而揭示该湿地的微生物多样性特征，对其生态修复有重要的指导意义。本论文采用传统纯培养的方法分离获得了会仙湿地底泥样品中的微生物，测定和分析分离菌株的16S rRNA基因序列，初步揭示该湿地底泥中的可培养微生物的群落组成特点和它们的重金属抗性，结合该底泥样品中高质量浓度五氯硝基苯耐药性菌株的分离分析，探讨它们对环境污染状态的指示意义。

1　材料和方法

1.1　实验材料

1.1.1样品采集2015年10月利用底泥采样器按《湖泊富营养化调查规范》[7]进行采集样品，采集点为会仙湿地睦洞湖泊(110°E 25°N)东南西北四个角离岸2 m处及中央位置5个区域中水流速度缓慢的沟渠底泥各5份，每份质量约500 g，剔除杂物和2 mm以上的沙砾，以四分法将5份样品等量缩为一份质量500 g的土样[8]。采样过程中用无菌手套取出样品并去除样品外围可能污染的部分，放至无菌袋中。当日运回实验室后4 ℃保存备用。

1.1.2培养基LB培养基：5 g/L Tryptone、2.5 g/L Yeast extract、5 g/L NaCl、12 g/L Agar；高氏一号培养基：20 g/L可溶性淀粉、1 g/L KNO3、0.5 g/L NaCl、0.5 g/L K2HPO4、0.5 g/L MgSO4、0.01 g/L FeSO4、12 g/L Agar。

1.2　实验方法

1.2.1菌株的分离菌株的分离主要参照苏进进[9]的相关方法进行，以无菌磷酸盐缓冲生理盐水(8.0 g/L NaCl、0.2 g/L KCl、1.15 g/L Na2HPO4、0.2 g/L KH2PO4，pH 7.3)悬浮2 g湿泥，28 ℃、170 r/min振荡40 min，10-1和10-2梯度稀释后取50 μL涂布固体培养基，28 ℃培养2～5 d后，根据涂布后肉眼观察平板菌落表面形态、菌落边缘形态、菌落隆起形态、透明度等菌落特征，尽可能挑选有差异的菌落于LB和高氏一号培养基中扩繁，平板划线法纯化获得纯菌。

1.2.2菌株DNA提取和16S rRNA基因扩增菌株DNA提取和16S rRNA基因扩增参照TANG Y W等[10]的实验方法。取0.5 mL纯菌液至1.5 mL离心管中，沸水水煮15 min后液氮速冻，重复3次。悬浮液12 000 r/min离心5 min，取1 μL上清液作为模板；以27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)为引物进行16S rRNA基因的扩增； PCR扩增程序为95 ℃ 10 min; 95 ℃ 45 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 1 min 30 s, 30个循环; 72 ℃10 min； PCR产物经w=1%琼脂糖凝胶进行电泳检测，回收和纯化1 500 bp的DNA片段，送上海生工生物工程股份有限公司测序。

1.2.3菌株16S rRNA基因序列分析将的得到的16S rRNA基因序列用DNAMAN软件进行排序并获得相似性矩阵，相似性≥97%的序列被认为来自相同分类单元(OTU, operational taxonomic unit)[11]，用其中一个序列和菌株作为代表提交GenBank数据库并获得该数据库的收录号(MF289499～ MF289521)，将每一个序列进行BLAST (http:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)相似性比对，根据比对结果选取参照序列，用Clustal X1.83进行排序，mega 5.0[12]软件基于NJ法构建会仙湿地分离菌株的系统发育树。

1.2.4有机砷耐受性检测在所分离菌株的培养基中加入100、200、500 mg/L对氨基苯胂酸，验证菌株对有机砷耐受度。

1.2.5耐PCNB菌种的富集、驯化用9 mL丙酮溶解0.01 g PCNB，滴加1 mL吐温作为增溶剂，配成PCBN质量浓度为1 g/L的母液，再量取PCNB母液加入到100 mL液体LB培养基中，使得培养液中五氯硝基苯的质量浓度为10 mg/L，取底泥样品10 g接入到含有PCNB的液体LB培养基的三角瓶中，30 ℃震荡培养一周后取1 mL菌液接种到新的培养基中，7 d为一个转接周期，按10、20、50、100、200 mg/L梯度依次提高培养液中五氯硝基苯的含量，经过一定时间的富集培养之后从液体培养基中取样涂布在含PCNB质量浓度为300 mg/L的固体LB培养基平板内，挑取单菌落进行多次平板划线纯化菌株。

1.2.6PCNB含量检测丙酮-石油醚萃取，磺化法处理，气相色谱法测定。进样口温度为250 ℃，色谱-质谱接口温度为280 ℃，离子源温度为250 ℃，四极杆温度150 ℃；色谱升温程序：初始温度80 ℃，保持1 min，以30 ℃/min的速率升至210 ℃，保持10 min；载气为氦气，流量为1.0 mL/min，不分流进样，进样量为1 μL。

2　结果和讨论

2.1　分离菌株多样性分析

分离共获得65株细菌纯培养物，分属于24个不同的OTUs。对这些菌株的16S rRNA基因序列的相似性分析结果(表1)表明，它们与已知菌株相似性均大于97%，其中43株菌的16S rRNA基因序列与厚壁菌门Firmicutes的芽孢杆菌属Bacillus、类芽孢杆菌属Paenibacillus、Fictibacillus属、Lysinibacillus属和肠球菌属Enterococcus中的菌株最相似，相似性97.29%～100%；10株与放线菌门Actinobacteria的链霉菌属Streptomyces、红球菌属Rhodococcus中的菌株最相似，相似性99.03%～100%；7株与变形菌门Proteobacteria假单胞菌属Pseudomonas、寡养单胞菌属Stenotrophomonas、泛菌属Pantoea、代尔夫特菌属Delftia的菌株最相似，相似性98.87%～100%；5株与拟杆菌门Bacteroidetes的金黄杆菌属Chryseobacterium最相似，它们的相似性均为99.48%。

基于16S rRNA基因的系统聚类分析表明， 会仙湿地底泥中可培养微生物中最优势的细菌为芽孢杆菌Bacillus(35株，占53.85%)，其次是链霉菌Streptomyce(7株，占10.77%)和金黄杆菌Chryseobacterium(5株，占7.69%)，它们占所有分离株的72.31%。

实验结果显示厚壁菌门主要是芽孢杆菌Bacillus占会仙湿地可培养原核微生物分离株的53.85%，已有的研究表明，大部分芽孢杆菌在有机物含量高的条件下会大量繁殖[13]；菌株LB D14的16S rRNA基因与FictibacillusphosphorivoransCa7TT(JX258924)的相似性为99.86%，后者最先从富含磷元素的样品中分离出，具有嗜酸除磷的特性[14]；菌株GS D8的16S rRNA基因与DelftialacustrisDSM21246T(EU888308)的相似性为99.93%，后者为肽聚糖降解菌，从富营养化的环境中分离出[15]；采样时我们也观察到的水面疯长水葫芦，由此推测，会仙湿地水体富营养化，与之前蓝运华[2]等报道相一致。值得注意的是，可培养的细菌中不少种类与条件致病菌的16S rRNA基因具有较高的相似性，如菌株LB A9 与BacillusanthracisATCC 14578T(AB190217)的相似性为99.85%，后者可引起吸入性炭疽热[16]；菌株LB D3与BacilluscereusATCC14579T(AE016877)的相似性100.00%，后者可引起腹泻或呕吐的食物中毒症状[17]；菌株GS A2与StenotrophomonasmaltophiliaMTCC434T(JALV01000036)的相似性为100%，后者也可能引起血流感染[18]；菌株ZYE A18与能引起败血症的PantoeabrenneriLMG5343T(EU216735)[19]的相似性为100.00%，而在已有的其它湿地底泥细菌多样性的文献报道中鲜有此类条件致病菌的报道，提示人为活动已经严重的影响了会仙湿地的原生态环境。另外，从该湿地底泥中也分离出一些具有特殊性能的细菌，如与菌株GS 39 16S rRNA基因相似性最高的StreptomycesharbinensisNEAU-Da3T(相似性99.78%)为具抗肿瘤活性的好氧菌，并能分解尿素[20]；与菌株ZYE C14相似性最高的Rhodococcusaetherivorans10bc312T(AF447391)(相似性为99.03%)是甲基叔丁基醚降解菌[21]；菌株Cu2(与DelftiatsuruhatensisT7T(AB075017)的同源性为98.87%)能对聚苯二甲酸乙二醇酯进行同化[22]，这些菌出现与当地农药化肥的滥用有着直接的关系。

表1　会仙湿地底泥分离的可培养细菌16s rRNA基因序列相似性比较结果Table 1　Homologous comparison results based on the comparison of the 16S rRNA sequences of bacterias isolated from the sediment of Huixian wetland

2.2　有机砷耐受性分析

在24个属的65个分离株中，有12个属30株菌耐受对氨基苯胂酸，其耐受性均在100 mg/L及以上(表2)。在Bacillus中，具有耐受性的菌株占该属分离株总数的29.41%。对氨基苯胂酸属于芳香族氨基化合物，具有抗菌、抑菌的特点[23]，是一种全合成抗菌剂，常被添加到饲料中，用于医治家禽细菌感染。会仙湿地有机砷耐受菌的出现从某种程度上说明会仙湿地环境正受到的污染，也说明了人类活动对湿地生态环境的影响。由结果可见，有机砷抗性具有菌株特异性。已有的有机砷抗性菌隶属8个属，分别是芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属、Fictibacillus属、Lysinibacillus属、红球菌属、泛菌属、代尔夫特菌属、金黄杆菌属，这些属中只有部分菌株表现抗性，且耐收质量浓度在不同菌株中存在一定差异。目前有报道芽孢杆菌能够对砷进行生物积累[24]，这些耐受菌株的分离，可能在日后用于湿地生态修复和环境污染治理中。

2.3　耐PCNB菌种分离

分离出一株对PCNB具有强耐受性的菌株W2，耐受质量浓度300 mg/L以上PCNB，经16S序列比对，其与屎肠球菌属EnterococcusfaeciumCGMCC1.2136T(AJKH01000109)菌株的相似度为100%。用全扫描质谱方式对含PCNB培养基中的菌株代谢产物进行了检测，结果如图2、图3所示。根据气相色谱-质谱仪对样品检测的结果与质谱谱图数据库进行数据分析，最高的色谱峰与五氯硝基苯的匹配度为99.99%，其对五氯硝基苯无降解作用。

图1　基于会仙湿地底泥可培养原核微生物16S rRNA基因序列的系统聚类树Fig.1　Phylogenetic dendrogram based on the comparison of the 16S rRNA sequences of microbes isolated from the sediment of Huixian wetland

分离菌株编号典型菌株(登录号)相似性/%耐受质量浓度/(mg·L-1)LBA9BacillusanthracisATCC14578T(AB190217)99.85100LBD3BacilluscereusATCC14579T(AE016877)100.00500LBB21BacillussafensisFO-36bT(ASJD01000027)99.24100LBD13PaenibacillusbarcinonensisBP-23T(AJ716019)98.28200LB311PaenibacillusagaridevoransDSM1355T(AJ345023)99.07200LBD14FictibacillusphosphorivoransCa7TT(JX258924)99.86200LBB19LysinibacillussphaericusKCTC3346T(AUOZ01000024)99.93200ZYEC14Rhodococcusaetherivorans10bc312T(AF447391)99.03200GSD8DelftialacustrisDSM21246T(EU888308)99.93500Cu2DelftiatsuruhatensisT7T(AB075017)98.87500ZYEA18PantoeabrenneriLMG5343T(EU216735)100.00200LBC12Chryseobacteriumgambrini5-1St1aT(AM232810)99.48200

在所发现的肠球菌中，很多菌种都具有极强的耐药性，并且大多数肠球菌为多重耐药菌株。肠球菌耐药性包括固有耐药、获得性耐药和耐受性，对青霉素、万古霉素、头孢类、低质量浓度氨基糖苷类等多种抗菌药物呈现固有耐药[25-27]。意大利科学家在鲜奶奶酪中发现的Enterococcuslactissp.具有毒力因子和抗生素耐药性[28]。蓝运华[29]在会仙湿地的底泥中检测出少量PCNB及其降解产物PCA。分离到的菌株W2为肠球菌，该菌株对PCNB具有极强的耐药性，对PCNB的耐药质量浓度在300 mg/L以上，目前，已经报道过细菌对PCNB的耐受性在200 mg/L以上[30]，而耐受能力在300 mg/L以上的细菌鲜有报道。在对多种药物均具有耐受性的肠球菌的研究中，也很少有肠球菌耐受PCNB的报道。

图2　提取样品总离子流图Fig.2　Ion chromatogram of samples extracted

通过气质联用测定从菌液中所分离的物质，由于色谱峰与五氯硝基苯的匹配度为99.99%，且在检测的离子丰度图中，离子强度最大的离子为237，237为PCNB的定量离子杆[31]，由此可判断分离提取的物质为PCNB，菌株W2对PCNB耐受性很强，但不具降解能力。PCNB耐受菌的出现，在一定程度上意味着当地已受到农药的污染，生态环境遭到人为的破坏，并且其对杀菌药物的耐受性值得引起足够的重视，多重耐药的特性使其一旦感染其它生物体致病后将难以进行药物治疗，对医学领域产生极大的挑战。

图3　提取样品全扫描离子相对丰度图Fig.3　Full scan ion relative abundances of samples extracted

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