尖吻蝮蛇凝血酶在大鼠体内的药代动力学*

邓沁，刘宏，苏薇薇，彭维，吴忠，王永刚，姚宏亮

(中山大学生命科学学院∥广东省中药上市后质量与药效再评价工程技术研究中心，广东 广州 510275)

尖吻蝮蛇凝血酶(Haemocoagulase Acutus，简写为Halase)是本团队从尖吻蝮蛇蛇毒中分离纯化的一种类凝血酶，研究表明其具有较强的止血作用，且无毒[1-6]。本文采用125Ⅰ标记的放射性同位素法(RA)、三氯醋酸沉淀结合放射性检测法(TCA-RA)研究尖吻蝮蛇凝血酶在大鼠体内的药代动力学，为临床应用提供参考，现报道如下。

1　材　料

1.1　试剂与仪器

尖吻蝮蛇凝血酶，实验室自制，纯度大于95%。三氯醋酸，上海化学试剂采购供应站。生理盐水，中国大冢制药有限公司。超纯水，用日本密理博公司的纯水器制备。微机多探头γ-计数器：北京核仪器厂，型号：FJ630G/12。

1.2　实验动物

Wistar大鼠，雌雄兼用，体质量200 g左右，由军事医学科学院四所动物实验中心提供，动物生产合格证医动字第005号。

2　方法与结果

2.1　125Ⅰ-Halase的制备

标记：采用氯胺T法进行尖吻蝮蛇凝血酶的125Ⅰ标记。

纯化：使用Sephadex G50凝胶柱分离纯化125Ⅰ标记物，收集125Ⅰ-Halase 测定放射比活性为52.3 mCi/mg (1 935 MBq/mg)，质量浓度为0.84 mCi/mL(31.1 MBq/mL)，放化纯度>95%。制备125Ⅰ-Halase色谱图见图1。

生物活性：测定125Ⅰ标记后的尖吻蝮蛇凝血酶在标准血浆中的凝血时间，以检验标记后的Halase生物活性。结果表明标记后不影响样品的生物活性。HPLC分析也证明标记前后色谱行为未改变，见图2。

图1　125Ⅰ-Halase色谱图Fig.1　125Ⅰ-Halase chromatogram

图2　Halase标记前后色谱比较Fig.2　Comparison between labeled Halase and unlabeled HalaseA: 标记前的Halase色谱图; B：标记后的Halase色谱图

2.2　测定方法的建立和验证

2.2.1标准曲线的制备以质量浓度为0.24 μg/mL的尖吻蝮蛇凝血酶(含放射性6.28 μCi/mL)配置标准液，以生理盐水为溶剂，配成质量浓度为0.03、0.06、0.12、0.30、0.60、1.20、3.00和6.00 ng/mL的标准液，各取200 μL标准液置于测定管中，在γ-计数器上测定1 min，将质量浓度与计数值(cpm)绘成标准曲线，标准曲线方程为：Y=25.8+5 660.8X(n=8，r=0.999 9)。

2.2.2校正曲线的制备

(1)RA法制备校正曲线：按标准曲线的尖吻蝮蛇凝血酶质量浓度和相应的125Ⅰ-Halase制备测定血清中尖吻蝮蛇凝血酶的校正曲线，结果显示质量浓度与cpm呈直线相关，校正曲线为：Y=56.3+5 479.8X(n=8，r=0.999 9)。质量浓度为0.12、0.60、6.00 ng/mL时，从血清中用RA法直接测定尖吻蝮蛇凝血酶的回收率，结果见表1 ；其日内、日间测定精密度结果见表2；本法最低能检测到0.03 ng /mL。

表1　血清中125Ⅰ-Halase的回收率(Mean±SD， n=5)Table 1　Percent recovery of 125Ⅰ-Halase in serum (Mean±SD， n=5)

表2　血清中125Ⅰ-Halase的测定精密度(Mean±SD， n=5)Table 2　Precision of 125Ⅰ-Halase in serum (Mean±SD， n=5)

同法制备测定心、脑、肝、肾、肌肉组织中125Ⅰ-Halase的校正曲线，以及尿、粪、胆汁的校正曲线，结果分别为：心：Y= 12.5+5 526.0X(n=8，r=0.999 9)；肝：Y= 98.3+5 225.3X(n=8，r=0.999 5)；肾：Y=61.4+5 350.1X(n=8，r=0.999 7)；脑：Y= 13.3+5 542.5X(n=8，r=0.999 7)；肌肉：Y= 68.5+5 338.8X(n=8，r=0.999 9)；尿：Y=219.8+4 915.1X(n=8，r=0.999 5)；粪：Y=138.0+4 882.7X(n=8，r=0.999 9)；胆汁：Y= 17.6+5 653.4X(n=8，r=0.999 9)。

(2)TCA-RA法制备血清校正曲线：按上述血清RA法校正曲线的制作方法，然后每管各加入φ=20%三氯醋酸(TCA)0.2 mL，振荡，离心(3 000 r/min, 10 min)，弃去上清液，测定沉淀物中尖吻蝮蛇凝血酶的含量，结果表明浓度与cpm呈直线相关，校正曲线为：A=24.7+4 197.7C(n=8，r=0.999 8)。

同法制备测定心、脑、肝、肾、肌肉三氯醋酸沉淀物中125Ⅰ-Halase的校正曲线，结果分别为：心：A= 43.5+3 892.3C(n=8，r=0.999 8)；肝：A= 97.2+3 758.2C(n=8，r=0.999 3)；肾：A= 70.8+3 811.1C(n=8，r=0.999 5)； 脑：A= 45.4+3 994.0 C (n=8，r=0.999 3)；肌肉：A= 86.1+3 969.4C(n=8，r=0.999 4)。

2.3　大鼠静脉给药三剂量的药代动力学研究

2.3.1 RA法

(1)总放射性浓度：本试验根据药效试验所用剂量，在安全、有效的剂量范围内，设计了大鼠静脉给药尖吻蝮蛇凝血酶 0.6、1.2和2.4 μg/kg3个剂量组，每100 g体质量给药体积为0.5 mL，每100 g体质量含125Ⅰ-Halase 3.142 μCi。给药后2、5、15、30 min，1、2、3、4、6、8、12、24、36和48 h 采血，分离出血清，2～30 min各取100 μL血清置于测定管中，1～48 h各取 200 μL血清置于测定管中，测定1 min的放射性。每一时间点6只大鼠，3 雌 3 雄。三剂量血药质量浓度-时间变化趋势比较见图3。

图3　用RA法测得的三剂量的血药质量浓度-时间曲线比较(Mean±SD， n=6)Fig.3　Comparison of plasma concentration-time curves of three doses using RA method(Mean±SD， n=6)

(2)药代参数：将实验数据用中国药理学会数学药理专业委员会的3P97实用药代动力学计算程序自动拟合c-t曲线，计算所得药代动力学参数结果见表3。用RA法所测得的iv血清中总放射性的消除半衰期t1/2β8～10 h，AUC与剂量呈正相关，r为0.999 8。

表3　 由总放射性测定求得的尖吻蝮蛇凝血酶的药代参数

2.3.2TCA-RA法

(1)血清中尖吻蝮蛇凝血酶质量浓度：本试验设计方案与总放射性测定方案相同，给药剂量与采血时间均同上，采血后取血清200 μL，加等量的φ=20%三氯醋酸，振荡，3 000 r/min，离心10 min，移走上清液，测定1 min沉淀物中的放射性。计算出尖吻蝮蛇凝血酶的质量浓度，每一时间点测定6只大鼠， 3雌3雄。三剂量血药浓度-时间变化趋势比较见图4。结果可见各时间点的尖吻蝮蛇凝血酶质量浓度与剂量相关，质量浓度比总放射性低，消除也比总放射性快。

图4　用TCA-RA法测得的三剂量的血药质量浓度-时间曲线比较(Mean±SD， n=6)Fig.4　Comparison of plasma concentration-time curves of three doses using TCA-RA method(Mean±SD， n=6)

(2)药代参数：将实验数据用中国药理学会数学药理专业委员会的3P97实用药代动力学计算程序自动拟合c-t曲线，计算所得药代动力学参数结果见表4。用TCA-RA法所测得的iv血清沉淀物放射性的消除半衰期t1/2β5～6 h，AUC与剂量呈正相关，r为0.999 0。

表4　由血清沉淀物含量求得的尖吻蝮蛇凝血酶的药代参数Table 4　Pharmacokinetic parameters of Halase calculated by serum sediments

2.4　组织分布试验

2.4.1RA法测定的总放射性的分布大鼠静脉注射尖吻蝮蛇凝血酶1.2 μg/kg ( 每100 g体质量给药体积为0.5 mL，每100 g体质量含125Ⅰ-Halase 3.142 μCi)，给药后5 min、30 min、2 h 、8 h和24 h 处死动物，取全血、脑、心、肺、肝、脾、肾、胃、小肠、肌肉、脂肪、卵巢、子宫和睾丸，每一组织脏器用水按1∶5的比例制成匀浆，取0.4 mL 进行总放射性测定，再根据校正曲线计算出各组织的放射活性含量；每一时间点取样6只动物，雌雄各半。结果见图5，从结果来看： 肝、脾和心在给药后5 min药物含量最高，其他绝大部分组织在给药后 30 min药物含量最高，以后逐渐降低；在各时间点，放射活性以肝组织含药量显著高于其他组织，脾、肺、肾、胃、心等组织含药量较高，脑、脂肪组织含量最低，除肝脏外各组织含药量都小于同期的血药含量。

2.4.2TCA-RA法测定的尖吻蝮蛇凝血酶分布在上述试验的基础上，对组织脏器进行了尖吻蝮蛇凝血酶原型药物的测定。取上述实验所得组织匀浆400 μL，加TCA 400 μL，振荡，3 000 r/min离心10 min，移走上清液，沉淀物进行放射性测定。求得组织中尖吻蝮蛇凝血酶含量。试验结果见图6所列，从结果来看： 肝、脾和心在给药后5 min药物含量最高，其他绝大部分组织在给药后 30 min药物含量最高，以后逐渐降低；在各时间点，放射活性以肝组织含药量显著高于其他组织，脾、肺、肾、胃、心等组织含药量较高，脑、脂肪组织含量最低。此法与RA法所得结果一致。

图5　大鼠静脉注射1.2 μg/kg尖吻蝮蛇凝血酶后用RA法测得的组织分布Fig.5　 Tissue distribution detected by RA method in rats injected with 1.2 μg/kg Halase (i.v.)

图6　大鼠静脉注射1.2 μg/kg尖吻蝮蛇凝血酶后用TCA-RA法测得的组织分布Fig.6　 Tissue distribution detected by TCA-RA method in rats injected with 1.2 μg/kg Halase (i.v.)

2.5　排泄试验

2.5.1尿排泄Wistar大鼠，雌雄各4只，静脉给药尖吻蝮蛇凝血酶1.2 μg/kg (每100 g体质量给药体积为0.5 mL，每100 g体质量含125Ⅰ-Halase 3.142 μCi ) 后放入代谢笼内，收集给药后0～2、2～4、4～6、6～8、8～12、12～24、24～36、36～48、48～72、72～96 h 的尿样和粪样，尿样稀释并计量，粪样用水制成匀浆后计量。取一定量的尿样置于测定管内，用γ-计数器测定1 min放射活性，见图7。从尿累计排泄量来看，给药后96 h内由尿排出的放射量约占给药剂量的73.52%，表明该药主要是由尿排泄。

2.5.2粪排泄在尿排泄试验收集到的粪样，制成匀浆后，取一定量的粪样置于测定管内， 用γ-计数器测定1 min放射活性，结果见图8，在 96 h 内粪累计排泄量占所给药剂量的 12.13%。

2.5.3胆汁排泄Wistar大鼠6只，雌雄兼用，体质量200 g左右。乌拉坦(1.2 g/kg，ip)麻醉后，胆管插管，iv 给药Halase 1.2 μg/kg ，收集给药后0～2、 2～4、 4～6、6～8、8～12 和12～24 h的胆汁，稀释后计量。取0.2 mL胆汁置于测定管内，用γ-计数器测定1 min放射活性，结果见图9。给药后24 h内由胆汁排出的药量占给药剂量的4.16%。

图7　大鼠静脉注射1.2 μg/kg尖吻蝮蛇血酶后尿排泄曲线Fig.7　Urinary excretion cure of rats injected with 1.2 μg/kg Halase (i.v.)

图8　大鼠静脉注射1.2 μg/kg尖吻蝮凝血酶后粪排泄曲线Fig.8　Fecal excretion cure of rats injected with 1.2 μg/kg Halase (i.v.)

图9　大鼠静脉注射1.2 μg/kg尖吻蝮蛇凝血酶后胆汁排泄曲线Fig.9　Bile excretion cure of rats injected with 1.2 μg/kg Halase (i.v.)

3　讨　论

应用放射性同位素法进行药代动力学研究时，测定原型药物是放射性同位素法测定中要解决的关键问题，因为药物进入体内后会被降解，总放射性测定不能代表原型药物，为此采用TCA沉淀蛋白法，使尖吻蝮蛇凝血酶沉淀下来而分解产物及游离125Ⅰ留在上清液中被除去，以使测定结果尽可能接近原型尖吻蝮蛇凝血酶的浓度。

从RA法和TCA-RA法研究的尖吻蝮蛇凝血酶组织分布表明，肝、脾和心在给药后5 min药物含量最高，其他绝大部分组织在给药后 30 min药物含量最高，以后逐渐降低，总放射性与原型药物在各组织分布的大小顺序基本一致。其中在大多数时间肝、脾、肾、肺含药量较高，脑、脂肪含药量较低。

静脉注射给药后96 h内，有给药总量的73.52%由尿中回收，12.13%由粪中回收，这部分可能与分布到胃肠及胆汁排泄有关，24 h内胆汁累积排泄量为4.16%。尿、粪 96 h 的总回收率达到 85.65%，说明尖吻蝮蛇凝血酶的排泄消除去向已较清楚。因此认为尖吻蝮蛇凝血酶排泄较完全，并主要由尿排泄。

尖吻蝮蛇凝血酶是一种糖蛋白，与血浆蛋白无特异性结合，国外文献和新药申报均未见有关蛋白结合报告，而且由于其药效作用(与血浆蛋白的作用)问题，会影响药物与蛋白的分离，不便进行游离药物的测定，因此本研究未测定相关结果。

参考文献：

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