外泌体在肝癌中作用的研究进展

冯思嘉(综述)　殷莲华(审校)

(1复旦大学上海医学院2013级临床医学八年制　上海　200032; 2复旦大学基础医学院生理与病理生理学系　上海　200032)

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是成人原发性肝癌中最常见的类型,也是导致全球癌症相关死亡的首要原因之一[1]。尽管一定条件下手术切除可以治疗肝癌,但由于缺乏早期检测和诊断的有效工具,很多晚期肝癌患者难以实施手术。因此需要找到敏感而特异的肝癌生物标志物用于肝癌的早期检测[2]。越来越多的研究表明,外泌体(exosome)miRNA在肝癌发生中有异常表达,其功能和机制复杂,对肝癌的诊治具有重要意义。

胞外囊泡胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)最初被视为实验制备血小板过程中的污染物,因此被称为“血小板灰尘”[3],是从各类正常或病变细胞释放到组织间液中的膜性囊泡。细胞可以通过分泌EVs与邻近或远处的细胞进行信息传递。EVs具有脂质双分子层膜结构,内含蛋白质、脂质及核酸等成分。根据亚细胞起源和囊泡大小可将EVs分成3种主要类型[4]:(1)在生理或者病理条件下,从细胞内多囊泡体中释放出的外泌体(直径30～100 nm);(2)在细胞应激进行胞吐时,从细胞质膜分离出的微泡(直径100～1 000 nm);(3)在细胞凋亡时,从细胞质中释放出的相对较大的凋亡小体(直径>1 000 nm)。在EVs形成时,细胞中的多种蛋白质、脂质、RNA和DNA分子会选择性地富集在这些囊泡中[1]。此外,EVs表面的信号分子能够针对性地引导其到达靶细胞;一旦附着至靶细胞,EVs可以通过受体与配体的相互作用、内吞或吞噬作用与靶细胞膜融合,将内容物输入靶细胞中来改变其生物学功能和状态。

外泌体外泌体几乎可由所有细胞经多囊泡体与质膜的融合而释放[5]。主要特点如下:(1)携带一系列信号分子,如细胞来源的表面受体、蛋白质(如膜蛋白、胞质蛋白及核蛋白等)、核糖核酸(主要为mRNA和miRNA)和脂质;(2)在不同体液(如尿液、羊水、腹水、唾液和血液等)中可以检测到不同类型的外泌体,并能通过不同方式将其从体液中分离出来;(3)可以通过生物屏障,将各类信号分子及功能性生物分子通过受体和配体间的相互作用或内化作用传递给靶细胞[6],并因携带的内含物不同而发挥不同的生物学功能(如肿瘤细胞来源的外泌体能够介导血管再生、肿瘤细胞增殖及免疫逃逸;树突状细胞来源的外泌体能够引起机体有效的抗肿瘤免疫应答等);(4)外泌体对细胞内核酸酶具有抵抗力,且在不同储存条件下具有高度稳定性,能保护自身不被破坏和降解[7]。外泌体miRNA在肿瘤中的作用为寻找肿瘤的理想生物标志物提供了新的可能[8]。

外泌体miRNA的多重生物学功能目前对于外泌体的功能尚无明确定论。Takahashi等[9]发现,肿瘤细胞产生的外泌体对靶细胞具有特殊效应,包括通过肿瘤细胞和靶细胞的表面受体与配体结合来激活靶细胞,并经水平传递的方式将具有生物学功能的分子转运入靶细胞。Sohn等[10]的研究表明,外泌体具有多种生物学功能,如免疫应答、抗原提呈、细胞内信息交流及不同种类RNA的传递等。Chiba等[11]的研究显示,大部分血清RNA富集在外泌体中,在体内循环的外泌体中所富集的miRNA在血液中相对稳定,能够保护自身抵御血液中核酸酶等酶类的降解;同时,不同种类的外泌体RNA可以在细胞间来回穿梭、传递信息,并能调节靶细胞的基因表达。

外泌体miRNA在细胞间的交流具有多重潜在功能。例如,可用来检测机体病理生理的改变、病变中的异常表现及多种疾病的诊断和预后等[5]。外泌体miRNA表达下调在肿瘤发生的机制中起着一定的作用[12]。正因外泌体及其内容物(以miRNA为主)能够反映来源肿瘤细胞和正常细胞的差异,外泌体在肿瘤的临床诊断中有很高的潜在价值[2,13]。在肿瘤高风险人群体内,检测肿瘤细胞来源的外泌体及其miRNA水平可能成为具有临床潜力和效用的崭新生物学工具[3]。

外泌体对肝癌细胞的作用肝癌细胞所产生的外泌体中RNA和蛋白质与正常细胞来源的有明显差异。这些外泌体可被其他细胞摄入和内化,并传递具有一定功能的基因[2]。类似于血清肿瘤标志物可用于肝癌的筛选,外泌体miRNA也可作为一项有价值的无创性生物标志物来区分肝脏炎症的类型和等级,进而辅助肝癌的早期诊断。研究显示,由于肝癌细胞中存在大量miRNA的变异,循环miRNA可能成为肝癌诊断的生物标志物[10,14]。

Wang等[8]对肝癌和慢性乙型肝炎患者血清外泌体miR-21表达的潜在临床意义进行了研究,定量RT-PCR结果显示,患者血清外泌体中miR-21的浓度远高于全血清中的平均浓度。由此对血清外泌体中富集的miR-21进行检测来筛选病变细胞,其灵敏度将高于对全血清中miR-21的检测。

外泌体中miR-18a的过表达会引起肝细胞增生及雌激素α受体水平下降;miR-221可通过蛋白激酶信号的增强实现外泌体在肝内细胞间迁移,对DNA损伤诱导的miR-222进行异常调节,从而导致肝癌的发生;miR-101表达下调可抑制细胞凋亡,从而诱发肝癌;miR-122可抑制肿瘤发生并调节肝癌细胞的转移;miR-195可抑制肿瘤发生并调节肝癌细胞的G1/S 细胞周期转换[10]。

尽管癌基因和抑癌基因的遗传与变异已被广泛研究,但对于促进肿瘤发展的表观遗传学机制的研究却不多[2]。Melo等[15]的研究表明,肝癌细胞可通过外泌体中miRNA的释放,从表观遗传的层面调节癌变细胞生长相关基因的表达和细胞间信号的传导。正因为外泌体对miRNA内容物有较强的选择性,外泌体miRNA到达靶细胞后具有向有效细胞基因表达和细胞行为转变的潜能[2,15]。Basu等[16]研究证实,外泌体miR-122可由人肝癌细胞Huh7分泌并传递给HepG2细胞,通过表达miR-122特有的低细胞周期蛋白G1,入侵HepG2细胞,抑制HepG2细胞的生长,加速其衰老。Lou等[17]发现,来源于脂肪间充质干细胞的外泌体也可将miR-122传递给HepG2 细胞,实现类似的细胞生长抑制效应,由此证明外泌体介导的细胞通讯还可以发生在不同来源的细胞中;研究还发现,外泌体在将miR-122传递给肝癌细胞时,还可以通过负调节miR-122的靶基因,提高肝癌细胞对化疗药物的敏感性。由此可见,外泌体miRNA在肿瘤浸润、转移和耐药中发挥了重要作用。

在肿瘤细胞中,外泌体介导的细胞间信号传导可能有促进肿瘤生长的作用。Takayuki等[2]研究证明,由于肿瘤细胞中存在特异miRNA的异常表达,具有调节多种癌基因和抑癌基因的能力,它可以利用自身miRNA介导的细胞间通讯来实现旁分泌或自分泌效应,从而促进肿瘤的发生发展[1,15]。

外泌体在肝癌转移中的作用外泌体介导的miRNA转运是肝癌细胞间沟通的重要机制。肝癌中一种独特的细胞间机制可能造成癌症的局部扩散、肝内转移或多灶性增长[3,16]。Ayuko等[18]通过检测肿瘤细胞来源的外泌体所携带的“肿瘤印记”,阐述其对肿瘤逃逸、肿瘤血管生成和肿瘤侵袭力的作用,表明肿瘤来源的外泌体可能对转移性癌灶形成有辅助作用。

Huang等[19]已经确认一条通过跨膜蛋白VASN(一种在癌变细胞中高表达的功能性蛋白)调节肿瘤转移的新途径,能通过外泌体介导的转运来影响内皮细胞的生物学功能。VASN阳性的外泌体能够提供由原发肿瘤细胞向周围细胞转移的信号,并作为肝癌发展过程中的信号载体介导细胞间通讯,这种由外泌体介导的肿瘤转移因子的转运,是诱导细胞迁移到癌旁组织的途径之一。与之类似的是,转移的肿瘤细胞在“出发”前会先行释放出外泌体。当这些外泌体到达预期转移的器官并被靶细胞摄取后,其内含物可以改变靶细胞的状态,从而营造一个适合转移而来的肿瘤细胞生长的微环境。在上述过程中,外泌体表面的整合素种类决定着靶器官的特异性,整合素αvβ5在肝癌转移中发挥作用[18]。

外泌体在肝癌复发中的作用Sugimachi等[7]的研究表明,外泌体中的功能性miRNA与肝硬化导致的肝癌复发有关。血清外泌体中特异的miRNA不仅可以作为肝癌诊断的生物标志物,还可以作为肿瘤复发的生物学功能分子。

外泌体miRNA的转运在以外泌体为遗传信息载体的癌症研究中引起了广泛关注。外泌体数据库ExoCarta显示,目前已确认2 838种来源于不同细胞类型和多种生物体的miRNA。其中,在肝硬化导致的肿瘤复发患者体内外泌体miR-718被显著抑制,可用于肝癌复发的预测和靶向治疗[7]。

外泌体在肝癌化学抗性和化疗应激中的作用Conigliaro等[20]发现了外泌体的一种鲜为人知的作用,即linc-ROR通过外泌体转运可作为细胞间通讯的媒介,应激细胞可发出“危险信号”给局部微环境中的其他细胞,以此进行细胞间联合应激(共同激活生存旁路等)。上述机制可以使肝癌组织获得化学抗性,引起化疗失效[9,18]。Takahashi等[9]评估了外泌体信号传递在肝癌对TGFβ反应中的作用,并提出重点研究这些细胞间信号转导的机制和媒介也许可以帮助增强肝癌细胞用于化疗药剂的敏感性和应答效果。该研究还证实,外泌体lncRNAs也参与了肝癌化疗应激并具有一定功能作用。表达谱显示肿瘤细胞来源的外泌体中富集着由2个不同细胞系所释放的lncRNAs。其中,linc-VLDLR在恶性肝细胞中的表达明显上调[21],它可由肿瘤细胞来源的外泌体转运,并调节靶点肝癌细胞对化疗的抗性。因此,lncRNA可以通过外泌体介导的细胞间信号转导来调节细胞对不利环境的应激。这一新作用可为肿瘤的发生发展和抗逆特性提供新的见解,并为增强肝癌化疗方案的治疗功效提供新的机遇[20-21]。

结语综上所述,不同细胞来源的外泌体具有不同的成分与功能,并受到细胞微环境的动态影响;对人体的生理与病理过程有重要作用,可作为疾病诊断的生物标志物。由于肿瘤细胞来源的外泌体对癌症的发生、发展、转移和复发有着复杂而重要的作用,故对肝癌患者体液中外泌体miRNA进行检测和分析能够为癌症的早期诊断、治疗效果评估和预后提供一定的参考和依据。未来研究应致力于外泌体的产生机制、外泌体miRNA选择性富集的原理及外泌体在肝癌中特定信号的传递过程,以进一步获得有关外泌体在肝癌中作用的新发现。

[1]MOHANKUMAR S,PATEL T.Extracellular vesicle long noncoding RNA as potential biomarkers of livercancer[J].BriefFunctGenomics,2016,15(3):249-256.

[2]TAKAYUKI K,LIN W,YAN I,etal.Inter-cellular nanovesicle mediated miRNA transfer:a mechanism of environmental modulation of hepatocellular cancer cell growth[J].Hepatology,2011,54(4):1237-1248.

[3]JULICH H,WILLMS A,LUKACS-KORNEK V,etal.Extracellular vesicle profiling and their use as potential disease specific biomarker[J].FrontImmunol,2014,5:413.

[4]COLOMBO M,RAPOSO G,THÉRY C.Biogenesis,secretion and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles[J].AnnuRevCellDevBiol,2014,30:255-289.

[5]ELDH M,BAGGE R,LASSER C,etal.miRNA in exosomes isolated directly from the liver circulation in patients with metastatic uveal melanoma[J].BMCCancer,2014,14:962.

[6]BAN L,SHACKEL N,MCLENNAN S.Extracellular vesicles:a new frontier in biomarker discovery for non-alcoholic fatty liver disease[J].IntJMolSci,2016,17(3):376.

[7]SUGIMACHI K,MATSUMURA T,HIRATA H,etal.Identification of a bona fide miRNA biomarker in serum exosomes that predicts hepatocellular carcinoma recurrence after liver transplantation[J].BrJCancer,2015,112(3):532-538.

[8]WANG H,HOU L,LI A,etal.Expression of serum exosomal microRNA-21 in human hepatocellular carcinoma[J].BiomedResInt,2014,2014:864894.

[9]TAKAHASHI K,YAN I,KOGURE T,etal.Extracellular vesicle-mediated transfer of long non-coding RNA ROR modulates chemosensitivity in human hepatocellular cancer[J].FEBSOpenBio,2014,(4):458-467.

[10]SOHN W,KIM J,KANG S,etal.Serum exosomal miRNAs as novel biomarkers for hepatocellular carcinoma[J].ExpMolMed,2015,47:e184.

[11]CHIBA M,KIMURA M,ASARI S.Exosomes secreted from human colorectal cancer cell lines contain mRNAs,miRNAs and natural antisense RNAs,that can transfer into the human hepatoma HepG2 and lung cancer A549 cell lines[J].OncolRep,2012,28(5):1551-1558.

[12]KOGURE T,YAN I,LIN W,etal.Extracellular vesicle-mediated transfer of a novel long noncoding RNA TUC339:a mechanism of intercellular signaling in human hepatocellular cancer[J].GenesCancer,2013,4(7-8):261-272.

[13]LI Y,ZHANG L,LIU F,etal.Identification of endogenous controls for analyzing serum exosomal miRNA in patients with hepatitis B or hepatocellular carcinoma[J].DisMarkers,2015,2015:893594.

[14]LI Y,ZHENG Q,BAO C,etal.Circular RNA is enriched and stable in exosomes:a promising biomarker for cancer diagnosis[J].CellRes,2015,25(8):981-984.

[15]MELO S,SUGIMOTO H,O’CONNELL J,etal.Cancer exosomes perform cell-independent microRNA biogenesis and promote tumorigenesis[J].CancerCell,2014,26(5):707-721.

[16]BASU S,BHATTACHARYYA S.Insulin-like growth factor-1 prevents miR-122 production in neighbouring cells to curtail its intercellular transfer to ensure proliferation of human hepatomacells[J].NucleicAcidsRes,2014,42(11):7170-7185.

[17]LOU G,SONG X,YANG F,etal.Exosomes derived from miR-122-modified adipose tissue-derived MSCs increase chemosensitivity of hepatocellular carcinoma[J].JHematolOncol,2015,8:122.

[18]AYUKO H,BRUNO C,SHEN T,etal.Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis[J].Nature,2015,19(527):329-335.

[19]HUANG A,DONG J,LI S,etal.Exosomal transfer of vasorin expressed in hepatocellular carcinoma cells promotes migration of human umbilical vein endothelial cells[J].IntJBiolSci,2015,11(8):961-969.

[20]CONIGLIARO,COSTA V,SAIEVA L,etal.CD90+ liver cancer cells modulate endothelial cell phenotype through the release of exosomes containing H19 lncRNA[J].MolCancer,2015,14:155.

[21]TAKAHASHI K,YAN I,WOOD J,etal.Involvement of extracellular vesicle long non-coding RNA (line-VLDLR) in tumor cell responses to chemotherapy[J].MolCancerRes,2014,12(10):1377-1387.