免疫球蛋白降低对复发性流产患者NK细胞的疗效评价

刘晓丽，邓飞越，周　杨，黄键宁，郭彩霞

(广州市增城区人民医院妇产科，广东 广州 511300)

目前我国处于社会和经济转型期，女性的生育年龄逐渐推后，复发性流产(recurrent spontaneous abortion，RSA)问题日益严峻[1]。越来越多的证据表明免疫因素在RSA的发病机制中起着重要的作用[2]，包括体液因素(如抗磷脂抗体、抗甲状腺抗体、抗细胞核抗体、免疫球蛋白M升高)和细胞因素(如自然杀伤细胞上升和抑制性T淋巴细胞下降)等，免疫作用对滋养层、胎盘和胚胎产生一定的毒性反应导致流产[3]，其中外周血自然杀伤细胞(natural killer，NK) 细胞数量和活性与不明原因复发性自然流产明显相关。自上世纪80年代以来，注射用免疫球蛋白(intravenous immunoglobulin，IVIG)一直被用于治疗RSA，通常被认为是通过降低NK毒性，使Th1/Th2平衡向Th2发展而发挥作用[4]，但对于NK细胞正常的RSA女性临床疗效目前尚不明确。为进一步明确IVIG对不同NK细胞水平RSA女性的治疗效果，本研究纳入部分患者进行对比分析，现报告如下。

1资料与方法

1.1一般资料

选择2011年10月至2015年12月在广州市增城区人民医院妇产科就诊的RSA患者，入选标准：①年龄20 ～40岁；②既往曾连续发生≥3次的无明显诱因自然流产；③抗磷脂抗体、抗核抗体、抗甲状腺微粒抗体等各种自身抗体阴性；④血清IgA水平正常；⑤了解研究内容并愿意配合检查，签署知情同意书。排除标准：①激素水平偏低或夫妇双方染色体异常；②泌尿生殖系统感染或活动性炎症；③内外生殖系统解剖异常或器质性病变；④严重的心肝肾或血液系统疾病，无法耐受IVIG治疗。符合入选标准的患者90例，按NK细胞是否正常分为NK细胞升高组(试验组，56例)和NK细胞正常组(对照组，34例)，90例患者均顺利接受IVIG治疗，无1例失访、中途退出或死亡，所有数据均纳入分析。

1.2方法

1.2.1治疗方法

试验组和对照组均给予IVIG(2.5g：50mL/瓶)500mg/kg，静脉注射，在卵泡期开始治疗，滴速控制在75mL/h，1次/月[5]，两组具体给药方案见表1。

表1两组IVIG用药方法

Table 1 Comparison of IVIG between two groups

组别持续用药方案成功妊娠者未妊娠者试验组★第二次用药前复查NK细胞，仍高于正常值者继续用药，如果NK细胞已恢复则暂停用药定期复查NK细胞，正常者继续观察，仍升高者IVIG用法同前疗程不超过半年对照组IVIG每月1次IVIG每月1次疗程不超过半年

注：★连续两次复查NK细胞仍为正常者停止用药，后续再出现NK细胞升高也不给药。

1.2.2检测指标

1.2.2.1 NK细胞NK细胞CD16和CD56抗原均有表达，同时CD3抗原阴性，因此CD3-/CD16+56+的细胞才是真正的NK细胞。患者晨起空腹抽取肘静脉血3mL，常规肝素抗凝后-4℃冷冻保存，使用Ficoll-Hypaque 法离心分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)，通过孵育、透化等处理后采用流式细胞仪(型号Biosciences AccuriC6，美国BD公司生产)测定患者NK细胞的范围。由于淋巴细胞亚群存在种族、性别和年龄差异，目前国内尚无淋巴细胞亚群正常值范围供参考，因此本研究采用姚春艳等[6]的研究结果(0.78%～11.71%)作为正常值标准。

1.2.2.2妊娠结局 详细记录两组患者的异位妊娠、孕周、分娩方式、胎儿宫内发育、胎儿体重、Apgar评分和并发症情况。世界卫生组织分娩指导对正常分娩的定义为产妇自产程开始到结束均为低危，胎儿单胎、头位，在37孕周和42孕周之间自然的发动宫缩，胎儿经阴道自然娩出，产后母亲与胎儿情况良好。并强调在正常分娩中，除非有确切必要的理由，不要干涉正常产程的进展[7]。

1.2.2.3不良反应 记录两组用药过程中出现与药物相关的不良反应(如输液反应、头痛)的发生情况。

1.3统计学方法

以SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，计量资料使用“Kolmogorov-Smirnov”作正态性检验，符合正态分布的数据以均值±标准差描述，组间比较采用独立样本t检验；不符合正态分布的数据以中位数(四分位间距)表示，组间比较采用Wilcoxon秩和检验；计数资料以百分率描述，组间比较采用χ2检验；均以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1一般情况

两组年龄、受孕方法、既往孕产次等资料组间比较差异无统计学意义(P>0.05)，而试验组NK细胞水平高于对照组(P<0.05)，见表2。

表2两组人口学及病情资料组间比较[χ±S,n(%)]

Table 2 Comparison of demographic and disease data between two groups[χ±S,n(%)]

比较项目试验组(n=56)对照组(n=34)t/χ2/ZP年龄(岁)32．37±5．5330．28±3．323．350．05受孕方式　自然受孕52(92．86)33(97．06)0．710．40　人工受孕4(7．14)1(2．94)既往孕次5(3，7)4(3，6)1．440．48既往产次　未产48(85．71)32(94．12)1．510．22　≥1次8(14．29)2(5．88)NK细胞比例(%)15．53(12．40，17．11)3．38(2．25，6．33)9．33<0．01

2.2妊娠情况

试验组和对照组各有早产儿3例和1例，剖宫产2例和1例，组间比较差异均无统计学意义(P>0.05)；两组均无异位妊娠、胎儿宫内生长迟缓和畸形病例，未出现产后出血、羊水栓塞等并发症；试验组妊娠率、正常分娩率均高于对照组，组间比较差异有统计学意义(P<0.05)，而流产率低于对照组(P>0.05)，见表3。

2.3不良反应

两组分别有部分患者出现输液反应、头痛和过敏等不良反应，无肝肾功能损害病例，两组不良反应发生率分别为10.71%和17.65%，组间比较差异无统计学意义(χ2=0.88，P=0.35)，见表4。

表3两组妊娠情况比较[n(%)]

Table 3Comparison of pregnancy between two groups[n(%)]

比较项目试验组(n=56)对照组(n=34)χ2P妊娠率49(87．50)11(32．35)28．95<0．01正常分娩率40(71．43)4(11．76)30．14<0．01流产率4(7．14)5(14．71)1．340．25早产3(5．36)1(2．94)0．290．59剖腹产2(3．57)1(2．94)0．030．87

表4两组不良反应发生率比较[n(%)]

Table 4 Comparison of incidence of adverse reactions between groups[n(%)]

类别试验组(n=56)对照组(n=34)输液反应2(3．57)3(8．82)头痛3(5．36)1(2．94)过敏反应1(1．79)2(5．88)肝肾功能损害00合计6(10．71)6(17．65)

3讨论

3.1复发性流产发病机制及治疗方法进展

RSA的病因包括夫妻染色体异常、母亲生殖器器质性或功能性病变、激素水平改变、环境生活因素、免疫功能和心理因素异常等[8]，其中免疫因素引起的流产被称为免疫性流产，尤其是对年龄>30岁的女性[7]。年龄是RSA病因划分的重要因素，年轻RSA女性(<30岁)通常是由于甲状腺功能异常、基因变异、子宫畸形、血糖异常和吸烟等，而高龄RSA女性(≥30岁)异倍体和免疫功能异常则是关键病因，其免疫异常主要表现为Th2细胞比例下降而Th1细胞上升，使机体免疫应答系统从生育模式转变为病原防御模式[9]。

RSA的治疗一直处于争议状态，由于狼疮抗凝综合征和抗磷脂抗体促进血栓的形成，使用肝素和阿司匹林的抗凝策略曾一度盛行，该疗法有效率接近80%，但也导致16%的女性发生出血，甚至出现致死性出血事件[10]。后期研究意识到免疫因素的重要性，免疫调节治疗逐渐在临床普及，但糖皮质激素只对抗细胞核抗体阳性的病例有效率较高，其他类型的RSA无效，而且不良反应相当明显，甚至可导致胎儿早产[11]。同种异体淋巴细胞免疫治疗对部分RSA孕妇有一定效果，但总体有效率仍然偏低，而且有严重过敏反应和注射部位瘢痕疼痛的病例报告，目前已经被大多数医疗机构淘汰，现在主要采用患者配偶或健康人群的淋巴细胞进行主动免疫治疗和丙种球蛋白被动免疫治疗两种方法[12]。

3.2 NK细胞在复发性流产发病的病理作用

NK细胞是与T、B细胞并列的第三类群淋巴细胞，占外周血淋巴细胞总数的10%～15%，有一定的细胞毒性效应，无需抗原预先致敏就可自发杀伤靶细胞，还可以通过分泌细胞因子发挥免疫调节作用。NK细胞也可能通过产生穿孔素并促进NK细胞活化，参与早产的免疫发病机制[13]。研究表明外周血NK细胞数量上升与RSA相关，无RSA病史的女性血清NK细胞比例为5%～8%，而RSA病史的女性NK细胞比例可上升至9.5%～17%，有研究表明以血清NK细胞的比例(界值为>16.4%)作为妊娠结局的预测指标，预示染色体核型正常的妊娠也可能发生异常妊娠或自然流产[14]。免疫治疗可降低RSA患者NK细胞水平，即使使用了肝素、阿司匹林和泼尼松等抗炎药物，25%～30%的妊娠病例仍然发展为流产，而该部分孕妇使用免疫球蛋白(IVIG)后NK细胞<9%，可使妊娠的成功率上升至82%[6]。

3.3免疫球蛋白对NK细胞升高性复发性流产的治疗意义

虽然IVIG实际的治疗机制目前尚不明确，调节淋巴细胞活性和细胞因子水平可能是起效原因，但也有研究认为IVIG并无确切的治疗价值[15]。Cohen等[5]认为可能的原因是这类研究故意排除了高龄女性，而且IVIG的用量不合理或过量，甚至纳入了部分免疫功能异常的女性。本研究以NK细胞作为分组依据，考虑到IVIG的半衰期为23～30d，4周的疗程足以达到免疫调节、完成Th1和Th2细胞转换的目的；同时，有1/3的女性在妊娠期出现NK细胞水平提高，如果没有在妊娠期停止IVIG可导致25%的女性发生妊娠晚期流产[16]，因此笔者谨慎地采用每月1次的治疗方法，有效地避免了NK细胞的再度升高，研究结果表明IVIG对NK细胞升高的RSA女性有确切的治疗效果，而NK细胞水平正常组有效率却较低，可能是因为该部分女性流产的病因与免疫功能关系较弱，而确切的机制需要更多的研究证实。

本研究试验组IVIG治疗有效的原因有几点：①试验组均为NK细胞升高的女性；②IVIG治疗在受孕前开始进行；③妊娠期间NK细胞上升的女性，继续给予每月一次的IVIG治疗;④由于入选的女性均为IgA水平正常的人群，IVIG过敏反应的风险大大降低[6]，因此合适的人群、适当的治疗起始时间是IVIG有效的关键。

综上所述，低剂量IVIG能有效改善NK细胞上升RSA女性的妊娠及正常分娩率，NK细胞应该成为RSA患者的常规检查。

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