宫腔粘连动物模型HSP47的表达及对生育力的影响

张泽松， 王祥珍，马娜娜， 廖海彬

(1.深圳市南山区妇幼保健院，广东 深圳 518052；2.新乡医学院第一附属医院，河南 新乡 453100； 3.深圳市光明新区人民医院，广东 深圳 518106)

宫腔粘连(intrauterine adhesions, IUAs) 又称Asherman 综合征，是指由于各种因素所致宫腔或颈管基底层内膜损伤后，宫腔肌壁和(或) 颈管的相互粘连[1]，感染、手术等任何引起子宫内膜破坏的因素都可引起IUAs[2]。最新研究显示，IUAs发病率约19.1%[3]，IUAs患者可出现月经量减少、继发闭经、腹痛、习惯性流产、胎盘植入甚至不孕等临床问题，严重影响育龄妇女的生殖健康[4-5]。热休克蛋白47(heat shock protein 47，HSP47)是一类小分子多肽蛋白，为机体受到外界不良因素侵犯时产生的一种保护性应激蛋白，普遍存在于自然界的原核和真核细胞中。宫腔粘连为宫腔损伤后的继发疾病，可能与宫腔内HSP47的激活和过度表达密切相关。HSP47与宫腔粘连的关系以及粘连宫腔对生育力的影响目前研究不多。本试验通过研究宫腔粘连动物模型子宫内膜HSP47和HSP47mRNA的变化，探讨HSP47在宫腔粘连中的作用及宫腔粘连对生育能力的影响。

1材料与方法

1.1主要试剂和仪器

兔抗HSP47单克隆抗体，SP 试剂盒及二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)显色剂，异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)标记的兔二抗(北京中杉金桥有限公司)，水合氯醛(国药集团，批号20121026)，苯酚(广州金华大化学试剂有限公司，批号 20130110)，阿拉伯树胶(天津市科密欧化学试剂有限公司，批号 201000710)，Masson染色试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司)，RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、荧光定量试剂盒(日本TAKARA公司)，LEICA 显微镜(德国)。

1.2实验动物与宫腔粘连模型建立

广东医学院动物中心提供健康性成熟S-D大鼠90只，其中雄性大鼠30只，雌性大鼠 60 只，体重 180～200g，常规喂养2周。雌性大鼠随机分为造模组30只，假手术组 15只，正常组15只。将造模组雌性大鼠麻醉后，于下腹部正中和尿道上端约1.00cm处切开皮肤，暴露子宫，用4号针头于子宫分叉处向左卵巢方向缓慢注入25%苯酚胶浆0.04mL(液化苯酚5mL，阿拉伯树胶1g，甘油4mL，加蒸馏水至20mL，配成25%的苯酚胶浆)。将假手术组雌性大鼠开腹后，向右侧子宫注入0.04mL生理盐水。正常组雌性大鼠不做任何处理。术后10天，随机选取造模组15只，假手术组及正常组各7只处死，取出各组大鼠的子宫，肉眼观察其宫腔改变，苏木精-伊红(hematoxylin-Eosin, HE)染色观察病理变化，免疫组化染色检测大鼠子宫内膜HSP47的表达，聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)检测HSP47 mRNA的表达。可见造模组子宫凹凸不平，部分远端积水，石蜡包埋切片见宫腔狭窄、变形、宫腔消失、纤维组织增生,见图1。余下的雌性大鼠，随机将造模组、假手术组和正常组与雄性大鼠一对一合笼饲养，次晨行雌鼠阴道细胞涂片，以涂片发现精子当日为妊娠第1 天(D1)，妊娠第10天(D10)开腹，计数双侧宫腔的妊娠胚胎数目作为生育力评价指标。

注：A为正常子宫；B为假手术子宫；C为宫腔粘连子宫。

图1造模后子宫大体观察

Fig.1Overall observation on various uterus after modeling

1.3 HSP47免疫组化检测

分别取三组大鼠子宫内膜组织，制备3μm组织切片进行HE染色和Masson染色。切片脱蜡处理，将切片用0.01mol枸橼酸盐缓冲液修复，PBS冲洗，羊血清封闭，滴加兔抗HSP47(1:100)4°C过夜，PBS冲洗，滴加二抗，DAB显色，苏木精复染，常规脱水、透明、封片。阴性对照组用同种血清代替一抗，空白对照组用PBS代替一抗，细胞浆内出现棕黄色颗粒，着色高于背景底色为阳性，细胞浆内不着色或呈浅棕色为阴性。400倍显微镜下随机取5个不同视野进行免疫组化评分。

1.4 HSP47 Real Time PCR检测

取液氮中冻存的大鼠子宫内膜组织，按TAKARA公司mRNA试剂盒说明书提取组织总RNA。根据TAKARA RT-PCR试剂盒说明进行cDNA的合成和PCR的扩增，逆转录的量不超过1μg，反应结束后统计CT值，根据荧光定量PCR的计算公式计算其相对表达量。

1.5双侧宫腔的妊娠胚胎计数

正常妊娠组胚胎孕囊成串珠状排列于子宫，单侧孕囊5～8个不等，造模组造模侧子宫无妊娠囊，其正常自身对照侧妊娠囊数目未见明显差别，见图2。

1.6统计学方法

采用SPSS 17.0统计处理软件。实验数据以均数±标准差表示，各组间比较采用单因素方差分析，组内比较采用配对t检验，以P<0.05为有统计学意义。

注：A为正常对照组；B为假手术组；C为造模组 IUA。

图2宫腔粘连对生育力的影响

Fig.2 Influence of IUA on fertility

2结果

2.1各组子宫内膜组织HE染色和Masson染色情况

造模术后第 10 天，造模侧HE染色可见子宫腔狭窄，几近闭塞，子宫内膜上皮消失。Masson染色可见间质内胶原纤维增多，排列紊乱，证实造模成功。宫腔粘连组右侧子宫作为自身对照，大体形态、病理学表现与正常组基本无异，见图3、图4、图5。

注：A为HE染色(40×)；B为HE染色(400×)；C为Masson染色(40×)；D为Masson染色(400×)。

图3正常和宫腔粘连子宫组织在HE和Masson染色后不同放大倍数组织学观察

Fig.3 Histological observation on normal uterus and IUA uterus tissues under different magnification times after HE and Masson staining

注(A：正常对照组，G造模后 J未造模 B：假手术组 H造模后 K未造模 C：宫腔粘连组 I造模后 L未造模)

图4HE染色(400×)后各组组织观察与对比

Fig.4Histological observation and comparison after HE staining (400×)

注：(A：正常对照组，G造模后 J未造模 B：假手术组 H造模后 K未造模 C：宫腔粘连组 I造模后 L未造模)

图5Masson染色(400×)后各组组织观察与对比

Fig.5 Histological observation and comparison after Masson staining (400×)

2.2子宫内膜HSP47的表达

HSP47阳性为黄棕色颗粒，定位于胞核，少数定位于细胞浆。免疫组化阳性细胞比例评分标准：I级0分，≤10%；Ⅱ级1分，11%～25%；Ⅲ级2分，25%～50%；Ⅳ级3分，> 50%。染色强度评分标准：无染色为0分；淡黄色为1分；棕黄色为2分；深棕色为3分。免疫组化结果根据染色阳性细胞数和染色强度分别评分，两者乘积0～1分为阴性(-)；2～4分为弱阳性(+)；5～6分为阳性(++)；6分以上为强阳性(+++)。其中(-)和(+)记为低表达，(++)和(+++)记为高表达。左侧子宫HSP47的表达，宫腔粘连组最高，与假手术组和正常组相比差异有统计学意义(t=9.07，P<0.05)，宫腔粘连组的高表达阳性率为80.00%，正常组和假手术组的高表达阳性率均为14.29%。假手术组和正常组相比差异没有统计学意义(χ2=3.19，P>0.05)，正常组和假手术组的高表达阳性率均为14.29%。右侧子宫HSP47的表达，宫腔粘连组高于假手术组和正常组，差异有统计学意义(t=10.14，P=<0.05)，宫腔粘连组的高表达阳性率为66.67%，正常组和假手术组的高表达阳性率均为14.29%。假手术组正常组相比差异没有统计学意义(χ2=0.00，P>0.05)，正常组和假手术组的高表达阳性率均为14.29%。宫腔粘连组左、右侧子宫HSP47的表达均增高，二者相比差异没有统计学意义(χ2=0.00，P>0.05)，左侧子宫高表达阳性率为80%，右侧子宫高表达阳性率为66.67%，见表1，表2。

表1HSP47在实验各组对照侧和造模侧子宫内膜的表达(n)

Table 1HSP47 expression in endometrium at control side and modeling side uterus among groups(n)

组别例数　　　HSP47的表达　　　-++++++高表达阳性率(++～+++)(%)对照侧　a7331014．29　b7331014．29　c15236466．67造模侧　A7331014．29　B7420114．29　C15126680．00

注：A(a)为正常组；B(b)为假手术组；C(c)为造模组。

表2HSP47在实验各组子宫内膜的相对表达量(χ±S)

Table 2Relative expression of HSP47 in endometrium in each group(χ±S)

组别例数(n)右侧表达量左侧表达量正常组71．08±0．501．06±0．28假手术组71．42±0．19#1．23±0．57#宫腔粘连组156．59±1．38∗6．29±1．09∗@

注：*为宫腔粘连组和假手术组、正常组相比P<0.05；#为正常组和假手术组相比P>0.05；@造模组左侧和右侧相比P>0.05。

2.3子宫内膜HSP47 mRNA的表达

左侧子宫HSP47 mRNA的表达，宫腔粘连组最高，与假手术组和正常组相比差异有统计学意义(P=0.04<0.05)，造模侧宫腔粘连组HSP47 mRNA子宫内膜的表达2-△△Ct值(χ±S)为(21.206±2.994)，正常组和假手术组的值分别为(0.992±0.199)和(1.678±0.645)。假手术组和正常组相比差异没有统计学意义(t=0.35，P>0.05)，正常组和假手术组的值分别为(0.992±0.199)和(1.678±0.645)。右侧子宫HSP47 mRNA的表达，宫腔粘连组高于假手术组和正常组，差异有统计学意义(t=10.14，P<0.05)，对照侧宫腔粘连组HSP47 mRNA子宫内膜的表达2-△△Ct值(χ±S)为(18.371±3.594)，正常组和假手术组的值分别为(0.989±0.215)和(2.057±1.074)。假手术组正常组相比差异没有统计学意义(t=0.35，P>0.05)，正常组和假手术组的值分别为(0.989±0.215)和(2.057±1.074)。宫腔粘连组左、右侧子宫HSP47 mRNA的表达均增高，二者相比差异没有统计学意义(t=0.35，P>0.05)，HSP47 mRNA在左侧子宫组织的相对表达量(χ±S)为(6.70±1.70)，在右侧子宫组织的相对表达量(χ±S)为(6.59±1.38)，见表3、表4。

表3HSP47 mRNA在实验各组子宫内膜的表达(χ±S)

Table 3Expression of HSP47 mRNA in endometrium in each group(χ±S)

组别例数(n)　　　　　　HSP47mRNA　　　　　　△Ct△△Ct2-△△Ct对照侧　a77．831±0．280140±0．2800．989±0．215　b76．948±0．6630．872±0．7692．057±1．074　c153．908±0．6193．912±0．61918．371±3．594造模侧　A77．824±0．3100．144±0．3100．992±0．199　B77．017±0．5320．663±0．5321．678±0．645　C153．514±7．0174．036±0．56421．206±2．994

注：A(a)为正常组；B(b)为假手术组；C(c)为造模组。

表4HSP47 mRNA在各组子宫组织的相对表达(χ±S)

Table 4Relative expression of HSP47 mRNA in uterus in each group(χ±S)

组别例数(n)右侧表达量左侧表达量正常组70．89±1．130．93±0．21假手术组71．18±0．24#1．10±0．12#宫腔粘连组156．59±1．38∗6．70±1．70∗@

注：*为宫腔粘连组和假手术组、正常组相比P<0.05；#为正常组和假手术组相比P>0.05；@为造模组左侧和右侧相比P>0.05。

2.4三组大鼠双侧子宫内妊娠胚胎数目比较

妊娠胚胎数，左侧子宫造模组为(0.20±0.40)个，正常组为(6.30 ±1.80) 个，假手术组为(6.30 ±2.90)个，差异有统计学意义(F=8.83，P<0.001)。右侧子宫造模组为(4.90±2.60) 个，正常组为(5.40±1.60) 个，假手术组为(5.90±3.00) 个，差异无统计学意义(F=0.39，P>0.05)。宫腔粘连组左侧子宫为(0.20±0.40)个，右侧子宫为(4.90±2.60)个，差异有统计学意义(t=6.92，P<0.001)。正常组和假手术组差异无统计学意义(t=0.57，P>0.05)，造模侧对照组和假手术组妊娠胚胎数分别为(6.30±1.80)和(6.30±2.90)，对照侧正常组和假手术组妊娠胚胎数分别为(5.40±1.60)和(5.90±3.00)，见表5。

表5各组造模侧和对照侧妊娠胚胎数目比较(χ±S)

Table 5Comparison of number of embryos at modeling side and control side in each group (χ±S)

子宫侧别正常组假手术组造模组IUA造模侧6．30±1．806．30±2．900．20±0．40对照侧5．40±1．605．90±3．004．90±2．60

3讨论

3.1HSP47与宫腔粘连的关系

性观念的开放及无痛人流的广泛开展，宫腔粘连的发病率逐年增高，宫腔粘连后子宫内膜变少，纤维结缔组织增生，宫腔变形、狭窄、体积缩小，子宫内膜供血不足，是引起不孕、体外受精胚胎移植失败及复发性流产的主要原因。近年来宫腔粘连的研究主要集中在治疗方面，对宫腔粘连的机制和从分子生物学水平进行宫腔粘连防治研究较少。

HSP47是一类分子量为47ku的小分子多肽蛋白，是当机体受到不良外界因素侵犯时产生的一种保护性应激蛋白，为存在于转录起始区上游的一种顺式作用元件，调控纤维蛋白原的生成。其特异性底物是纤维蛋白原，它存在于可以合成胶原纤维的内质网内，在细胞内质网内参与前胶原的装配、折叠、修饰、转运、活化、及分泌等过程，被称为“分子伴侣”[6-7]。

宫腔粘连的形成有许多细胞因子参与，现在比较公认的最主要的因子是TGF-β1，该因子可以激活多条信号传导通路促进纤维蛋白原的异常合成增多[8-9]。周曼萍等[10]的研究也显示 TGF-β1在 IUA 患者子宫内膜组织中的表达明显高于非 IUA 患者，且随粘连程度加重而逐渐升高，进一步验证了 TGF-β1和 IUA 的相关性，由此推测 TGF-β1的高表达可能参与了IUA 的发生发展。

TGF-β1是纤维化发生、发展中的启动因子，对各种组织器官纤维化的形成都具有非常重要的作用，是关键性细胞因子[9]。Kakugawa等[11]研究显示肺纤维化组织中HSP47与TGF-β1表达均升高，分析TGF-β1在纤维化疾病中可能是通过HSP47表达增多，使细胞内质网内纤维蛋白原产生过多。体外TGF-β1可以诱导多种细胞表达HSP47，TGF-β1也可在转录水平调节HSP47的表达，是促进HSP47 表达的主要因子[9]，特发性肺纤维化急性加重期血清内HSP47含量也增高[11]。

国内外众多学者研究证实，HSP47 表达与胶原分泌细胞分化及发育中的胶原蛋白数量密切相关[12]。肝纤维化的形成[13]、心衰患者心肌中胶原的合成、多种肾间质纤维化相关疾病[14]以及病理性瘢痕形成机制中，HSP47发挥着举足轻重的作用[15-16], HSP47在各种器官胶原异常聚集的纤维性疾病中均有所表达[7]。

本实验采用大鼠建立宫腔粘连模型，应用免疫组化、荧光定量PCR，测定宫腔粘连大鼠子宫HSP47蛋白和HSP47 mRNA在各组子宫内膜组织的相对表达，结果显示宫腔粘连组和假手术组、正常组相比差异均有统计学意义，假手术组和正常组差异没有统计学意义，宫腔粘连组左、右侧子宫内膜组织表达均增高，二者相比差异没有统计学意义(P>0.05)，排除了手术影响，提示宫腔粘连大鼠HSP47表达增高，进一步表明HSP47在宫腔粘连的病理过程中发挥了重要作用，HSP47可以作为胶原相关疾病治疗的潜在位点，为研究防治宫腔粘连的药物提供了新的方向。

3.2宫腔粘连对生育力的影响

宫腔粘连引起的继发不孕是不少患者就诊的首要原因。此方法造模后病理结果显示造模侧的子宫腔缩小甚至消失，胶原纤维增多，符合宫腔粘连的病理改变。

在本实验中发现，交配后阴栓出现的时间各个组间差异不大，大鼠的造模侧基本不孕，其自身对照侧正常妊娠， 胚胎数目和正常的大鼠无差异，造模侧和自身对照侧HSP47表达差异却没有统计学差异，似乎存在矛盾。

宫腔粘连及妊娠都有众多的细胞因子参与，各自的作用机制至今仍有很多疑问，比如NF-κB 与TGF-β1因子在妊娠、炎症期间，都有异常的表达，但二者均有双向调节作用，TGF-β1在诱导纤维化的同时也具有抗炎的作用，有报道缺乏TGF-β1的小鼠会死于广泛的炎症。NF-κB在多种基因的转录过程中起到调控作用，这些基因与免疫应答、胚胎发育、炎症、细胞凋亡及肿瘤等多种病理过程相关，因此与多种疾病的发生发展相关。NF-κB是由Rel蛋白家族中两个成员构成的二聚体复合物。Rel蛋白家族共有5个成员，分别为RelA(P65)、NF-κB1(P50/PL05)、原癌基因C-Rel、NF-κB2(P52/PL00)、RelB，其中最常见的是P65/P50异二聚体，也是其活性的主要形式。NF-κB可促进细胞因子如TNF、IL-1等的基因转录，在炎症反应中的作用至关重要，而P50和P52同型二聚体可以抑制转录，因为它们不存在转录激活区域。NF-κB活化在炎症反应起始阶段通过促炎性基因表达可加重炎症反应，而在炎症消散期，通过促凋亡基因、抗炎性基因等的表达，NF-κB活化可减轻炎症反应。张全等[17]研究发现大鼠重症急性胰腺炎的肺损伤中细胞凋亡增加可能与NF-κB活性升高有关。杜赵康等[18]通过研究Bax、Bel-2和NF-κB在肝再生早期中的表达结果表明，NF-κB表达可能与激活Bel-2抑制肝细胞凋亡从而促进肝细胞再生有关。在雪旺细胞中，NF-κB可被神经生长因子通过神经营养受体P75激活，而P75受体在细胞生存、细胞死亡中均有作用，因此确定在这种神经胶质细胞中NF-κB具有抑制凋亡和促进凋亡的双向作用[19]。

大鼠子宫有两个独立的宫腔，它们相对独立又相互统一，在粘连与妊娠的过程中这些神秘的细胞因子如何发挥作用，还有待于更加深入的研究探索。

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