p16INK4a和ki67在宫颈CIN Ⅰ～Ⅱ中差异性表达的意义

戈文舜，任丽芳，李美平，鲁　波，张　鹏，蔡红光，杨惠英，包　磊

(浙江省绍兴市妇幼保健院病理科，浙江 绍兴 312000)

宫颈癌作为发病率第二的妇科恶性肿瘤，与高危型人乳头瘤病毒(human papillomavir-uses，HPV)持续感染相关，随着宫颈癌筛查的广泛开展，很多宫颈癌前病变的早发现早治疗，大大降低宫颈癌的发病和死亡率。因此，对宫颈癌前病变的准确诊断及分级对于临床下一步治疗至关重要。2014年，第4版世界卫生组织(World Health Organiza￣tion，WHO)女性生殖系统肿瘤[1]分类用低级别鳞状上皮内病变(low-grade squamous intraepithelial lesions， LSIL)和高级别鳞状上皮内病变(high-grade squamous intraepithelial lesions，HSIL)替代第3版WHO乳腺及女性生殖器官肿瘤病理学及遗传学中宫颈上皮内瘤变的三级分类法(CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ)。对于宫颈LSIL，临床医师普遍采取定期复查、密切随访等处理措施，而HSIL则行宫颈环形电切术(loop electrosurgical excision procedure，LEEP)进行治疗。但在日常工作中，病理诊断会经常碰到镜下病变介于HSIL与LSIL之间(CINⅠ～Ⅱ)的情况，所以如何明确这种情况下的病变等级就成了首要解决的问题。近年来大量文献报道， p16INK4a和ki67在HSIL中阳性表达且阳性程度随病变的加重而升高。因此，本研究通过对CINⅠ～Ⅱ标本进行免疫组化p16INK4a和ki67检测，分析其表达情况与宫颈病变等级的关系及在病理诊断中的作用与意义。

1资料与方法

1.1一般资料

收集2012年1月至2015年12月在绍兴市妇幼保健院门诊行阴道镜检查，活检病理诊断为CINⅠ～Ⅱ同时行免疫组化p16INK4a和ki67检测，后续治疗均行LEEP病例53例。患者年龄为26～56岁，平均39岁。组织学切片由3位高年资病理医生复阅全部病理切片，至少2位医师意见一致则确定为最后诊断。诊断标准参照2014年WHO女性生殖系统肿瘤病理学和遗传学分类标准。

1.2方法

1.2.1免疫组织化学染色

标本经10%中性福尔马林固定，2～3μm厚石蜡切片，常规脱水、石蜡包埋切片。一抗p16(6H12)试剂、ki67(MIB-1)试剂、Envision试剂盒均购自Dako。免疫组化操作步骤按试剂盒说明书进行。

1.2.2免疫组织化学阳性标准

p16INK4a：病变层细胞核与/或胞浆连续强阳性表达标记为(++)；基底与/或副基底层细胞不连续或连续弱或至中等强度表达(+)；完全不表达标记为(-)。ki67：阳性信号位于胞核，以阳性细胞百分比数来体现细胞增殖指数。其表达程度借鉴组织学诊断标准(上皮下1/3为界)以30%为界限区分HSIL、LSIL(+，>30%；+，≤30%)。

1.3统计学方法

采用SPSS 13.0软件进行χ2检验和χ2分割法，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 CINⅠ～Ⅱ显微镜下组织学表现

本组资料中阴道镜活检病理诊断CINⅠ～Ⅱ的病例53例，其组织学表现，如下：①鳞状上皮基底及副基底层细胞轻度-中度异型增生，增殖细胞一般不超过上皮下1/3层，上皮上1/2层或上2/3层往往存在HPV感染表现(挖空细胞)，细胞核大小不等、染色质细颗粒状、均匀分布、轻度深染、界限清楚，见图1A、D、G；②少数病例为不典型鳞化和萎缩(鳞化、萎缩基础上基底及副基底细胞存在异型增生)，细胞层次一般10～15层，细胞异型程度同①,少许细胞核大、深染、核浆比较高,核膜规则。上皮薄、层次少，病变程度较难确定，见图1D；③个别病例因包埋切面的关系造成上皮脚较深长或者累腺处病变较重(上皮层总体病变为LSIL)，细胞异型程度同①，见图1。

2.2 CINⅠ～Ⅱ后续LEEP术结果

53例CINⅠ～Ⅱ患者后续LEEP术结果：LSIL 22例(41.51%，22/53)、HSIL 31例(58.49%，31/53，包含1例早期浸润性鳞状细胞癌)，见表1。

2.3 p16INK4a及其联合ki67检测的统计学意义

53例p16INK4a蛋白检测者，36例(67.92%，36/53)(++)，见图1H和17例(32.08%，17/53)(+)，见图1B、F；p16INK4a(++)联合ki67检测者，23例ki67(+，>30%)(63.89%，23/36)见图1C、I和13例ki67(+，≤30%)(36.11%，13/36)(见图1F)；两者阳性表达情况与宫颈病变分级明显相关，差异有统计学意义(P<0.05)。单纯行ki67或联合p16INK4a(+)者，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

2.4 p16INK4a联合ki67检测预测HSIL的价值

p16INK4a(++)联合ki67(+，>30%)检测和单纯行p16INK4a检测在CINⅠ～Ⅱ中预测HSIL的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值分别为76.00%(19/25)和80.65%(25/31)、63.64%(7/11)和50.00%(11/22)、82.61%(19/23)和69.44%(25/36)、53.85%(7/13)和64.71%(11/17)。

　

　

注：A、D、G为阴道镜活检组织学诊断CINⅠ～Ⅱ，其中图A累腺处病变程度较重 ；图D上皮层次较少、薄；A、G上皮上1/2或2/3存在明显的HPV感染；G在LEEP中上皮上1/2存在分化现象 (后续LEEP结果分别为LSIL、LSIL、HSIL伴早期浸润性鳞状细胞癌);HE 中倍放大；B、E、H分别为A、D、G的p16INK4a结果(+、+、++)，中倍放大；C、F、I分别为A、D、G的ki67结果(>30%、≤30%、>30%)，中倍放大。

图1CINⅠ～Ⅱ及其相应p16INK4a和ki67在显微镜下的表达

Fig.1Expressions of CIN Ⅰ-Ⅱ and its corresponding p16INK4a and ki67 under microscope

表1p16INK4a联合ki67检测与后续LEEP术病理诊断结果对照表[n(%)]

Table 1 Comparison of results of p16INK4acombined with ki67 detection and follow-up LEEP pathological diagnosis[n(%)]

检测项目　LEEP术病理诊断结果　HSIL(n=31)LSIL(n=22)χ2Pp16INK4a5．5470．019　(++)25(47．18)11(20．75)　(+)6(11．32)11(20．75)ki673．5010．061　(+，≤30%)9(16．99)12(22．64)　(+，>30%)22(41．51)10(18．86)p16INK4a(++)5．2020．023　ki67(+，≤30%)6(16．67)7(19．44)　ki67(+，>30%)19(52．78)4(11．11)p16INK4a(+)0．0320．858　ki67(+，≤30%)3(17．65)5(29．41)　ki67(+，>30%)3(17．65)6(35．29)

3讨论

3.1 p16INK4a与ki67在CINI～Ⅱ中差异性表达的机制及统计学意义

p16INK4a是细胞周期蛋白依赖性激酶CDK的抑制因子，负调控细胞周期，特别是在高危型HPV感染的HSIL和子宫颈癌组织中常常可检测到强阳性表达，原因是HPV E6、E7蛋白在子宫颈细胞内表达，竞争性抑制细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)与视网膜母细胞瘤蛋白(Rb)的结合，使Rb失活，激活转录因子E2F，造成p16INK4a蛋白过表达[2]。ki67是一种细胞增殖活性相关抗体，其阳性比例反映出细胞增殖指数。大量研究显示，p16INK4a及Ki67的阳性程度随CIN级别提升而增加，可以很好地辅助病理诊断[2-6]。但在宫颈病变细胞中p16INK4a阳性判读标准，查阅大量文献，各有不同。本实验通过观察p16INK4a蛋白和ki67在CINⅠ～Ⅱ中表达的差异性，对比后续LEEP结果(LSIL 、HSIL)寻找其阳性规律。结果发现，p16INK4a(++)和(+)，两者在病变分级中存在差异性，有统计学意义(P<0.05)。有关ki67的表达程度借鉴组织学诊断标准(上皮下1/3为界)以30%为界限区分HSIL与LSIL，虽然在CINⅠ～Ⅱ的基础病变中ki67增殖指数主要集中在30%左右,但是其中LEEP结果为LSIL(特别是湿疣)的病例ki67(+，>30%)所占的比重不低(45.45%，10/22)，差异无统计学意义(P>0.05)。但是在p16INK4a(++)的基础上结合ki67检测，ki67(+，>30%)与(≤30%)之间差异有统计学意义(P<0.05)，而且p16INK4a(++)结合ki67(+，>30%)对比单纯p16INK4a(++)，就预测HSIL而言，敏感性及阴性预测值相差不大，特异性和阳性预测值却有显著提高。

3.2 p16INK4a结合ki67在CINⅠ～Ⅱ中差异性表达的诊断意义及预测价值

CINⅠ～Ⅱ患者，本身存在基底及副基底层细胞异型增生的基础病变，这部分病变层细胞如果表达p16INK4a(++)及ki67(+,>30%)，那么其后续为HSIL的可能性大大增加，这也符合p16INK4a及ki67的阳性率随病变级别提升而增加的特点。然而，有学者认为超过30岁的LSIL患者进展的风险更高，其预后与p16INK4a过表达无关，而是年龄[7]；也有学者认为p16INK4a在CINⅠ患者中阳性表达存在一定预测价值，应进行重点随访[8]。

p16INK4a在LSIL中确实存在阳性表达，在CINⅠ～Ⅱ中,特别是p16INK4a(+)，类似乳腺癌CerbB-2在癌组织中表达1+或2+的阳性状态，其表达意义和预后情况是否与p16INK4a(-)一致，今后需要进一步大样本分析。现阶段本实验结论：p16INK4a可以作为早期宫颈病变预后的预测因子，在CINⅠ～Ⅱ患者中，若p16INK4a(++)及ki67(+,>30%)则可作为HSIL的辅助诊断。

总之，对不典型鳞化、萎缩及包埋切片造成假象的或者诊断意见不统一等有疑问的CINⅠ～Ⅱ活检标本可以进行p16INK4a及ki67染色，以提高病理诊断的准确性和可重复性。p16INK4a蛋白病变层细胞核与/或胞浆连续强阳性表达是LSIL发展为HSIL的重要信号，联合ki67(>30%)检测可用于分流CINⅠ～Ⅱ，对这类患者临床应根据其实际情况选择密切随访或及时治疗。

[参考文献]

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