紫黑翼蚌钩介幼虫寄主鱼的人工筛选及寄生包囊形成观察

闻海波　马学艳　徐　跑　张呈祥　徐　良金　武　华　丹　顾若波

紫黑翼蚌(Potamilus alatus)也称紫踵劈蚌, 隶属于蚌科Unionidae, Lampsilinae亚科, 原分布于美国的湖泊和河流, 为大型双壳类, 最大壳长达18 cm以上, 珍珠层厚实, 呈紫黑色, 且光滑细腻, 极富光泽[1]。在Clinch河中发现有4种淡水蚌类能形成天然珍珠, 其中就包括紫黑翼蚌[2]; 进一步的插珠试验研究表明： 紫黑翼蚌具有培育淡水紫黑珍珠的潜力[3]。为在我国发展紫黑珍珠养殖, 2012年中国水产科学研究院淡水渔业研究中心从美国引进一批紫黑翼蚌幼蚌, 在国内开展人工驯养, 并系统开展了养殖基础生物学研究[4,5], 2013年底成功培育出一批亲蚌, 为我国突破紫黑翼蚌的人工繁育奠定了重要基础。

大多数蚌类具有特殊寄生变态发育过程, 筛选出适宜的寄主鱼是实现其人工繁育和增殖保护的前提条件。目前, 淡水石首鱼被认为是紫黑翼蚌唯一的天然寄主鱼[6—9]。由于我国缺乏淡水石首鱼,极大地制约着紫黑翼蚌苗种的人工繁育。筛选出合适的替代寄主鱼实现钩介幼虫的寄生变态发育,是突破我国紫黑翼蚌人工繁育的关键技术环节。

本研究分为紫黑翼蚌原产地寄生试验和国内替代寄主鱼筛选试验。其中, 前者选取特定寄主鱼和3种潜在寄主鱼进行筛选, 通过脱落幼虫和稚蚌的收集统计, 首次评估了紫黑翼蚌在淡水石首鱼寄生的稚蚌变态率, 并对其寄生变态的钩介幼虫进行了形态学观察; 在国内, 从鲤形目、鲈形目、鲇形目和鲀形目中选取具有代表性的12种鱼类开展人工寄生试验, 对不同鱼类的寄生效果进行了比较;采用扫描电镜对钩介幼虫在眼斑拟石首鱼鳃丝寄生形成包囊的形态变化进行比较观察, 对作为替代寄主鱼的潜力进行了评估, 相关研究结果将为突破我国紫黑翼蚌寄生繁殖关键技术提供重要参考。

1　材料与方法

1.1　紫黑翼蚌原产地寄主鱼的筛选

实验动物采集紫黑翼蚌孕育雌蚌于2013年11月份采集于田纳西河上游, 编号为S632、S623,壳长分别为11.53和10.23 cm。选取淡水石首鱼、蓝鲶(Ictalurus furcatus)、小口黑鲈(Micropterus dolomieu)及牛头鲶(Ameiurus nebulosus)作为寄生鱼, 相关信息如表 1。4种试验鱼用电捕法采集于田纳西河。用18号无菌注射器吸取灭菌纯水, 将针头从孕育蚌育儿囊中部平行插入, 将灭菌水注入并同时缓慢抽出针头, 使幼虫从育儿囊中排出, 再用洗瓶将幼虫全部冲入500 mL的烧杯中, 显微镜下检查幼虫活力, 判断标准参考Hua[8]。

钩介幼虫寄生及寄生鱼暂养寄生试验在弗吉尼亚理工及州立大学淡水贝类保护中心(Freshwater Mollusk Conservation Center, FMCC)进行, 用吸管将块状的钩介幼虫轻轻吹散, 放入50 cm×40 cm×25 cm的塑料水箱中, 水体为20L充分曝气的自来水, 幼虫密度为2—3个/mL, 水温18—19℃, 将4种寄生鱼放入水箱中寄生25min后捞出, 分别暂养在循环控温养殖系统内, 其中5尾淡水石首鱼FD1、FD2、FD3、FD4、FD5分别放养在单独的养殖系统内,蓝鲶(BC)、牛头鲶(BUC)、小口鲈(SB)分别置于3个不同养殖系统内, 养殖缸的出水口设置200目尼龙过滤袋, 收集养殖缸中部分脱落的幼虫或稚蚌。养殖水温保持在20—22℃, 养殖水体氨氮0.03—0.5 mg/L, 亚硝酸盐氮0.002—0.006 mg/L。

脱落幼虫及稚蚌的收集统计在鱼体寄生后每2d采用虹吸法收集养殖缸底部, 并与过滤袋中的幼虫或稚蚌合并观察和计数。在OLYMPUS BX41显微镜下观察幼虫形态, Q-Color3图像采集器拍照。取少量幼虫或稚蚌, 2.5%戊二醛浸泡, 用于扫描电镜观察, 具体方法参考Wen等[5]。按下列公式计算变态率。

变态率=变态稚蚌数/钩介幼虫寄生总数×100%。

1.2　国内替代寄主鱼的筛选

孕育蚌及幼虫采集2013年10月至2015年4月, 自中国水产科学研究院淡水渔业研究中心江阴紫黑翼蚌驯养基地, 采集成熟孕育蚌若干只用于寄生试验。

寄生用鱼采集及人工驯养从国内选取12种养殖鱼类进行紫黑翼蚌替代寄主鱼的人工筛选, 共开展3次替代寄主鱼的筛选试验, 寄生用鱼类的基本信息详见表 2。其中黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)、沙塘鳢(Odontobutis obscurus)、鳜(Siniperca chuatsi)采集江阴水产市场, 其他淡水鱼均来自江阴市申港三鲜养殖有限公司, 所有鱼试验前暂养2—3星期, 选取体质健壮、无伤的个体用于钩介幼虫寄生。在第2次试验中, 大规格的眼斑拟石首鱼为青岛海水网箱养殖, 低温充氧运输至江阴试验基地, 经过2个月人工淡化驯养, 水体盐度逐步淡化至5‰后用于寄生; 在第3次试验中, 眼斑拟石首鱼为2014年9月从福建漳州采购的2—3 cm鱼苗,经人工驯养至鱼体长7—8 cm, 并逐步淡化至1.2‰后用于寄生试验。

钩介幼虫寄生将吹散和清洗后的钩介幼虫放入塑料寄生箱内, 幼虫密度控制在2000—3000只/L, 寄生水温为(20±1)℃, 调节曝气量以保持幼虫均匀悬浮; 将鱼同时放入寄生箱内, 寄生10—20min,并随时检查寄生鱼鳃丝上幼虫的数量, 以每片鳃丝单面有30—50只, 具体可视鱼体规格而定。

寄生鱼的暂养寄生后将鱼暂养在自动控温循环养殖系统内, 水体为充分曝气的自来水(淡水), 水温为(20±1)℃。在第二次试验中, 眼斑拟石首鱼经2个月逐步淡化至5‰, 寄生前将置于淡水中适应1d后再进行寄生; 第3次试验中, 眼斑拟石首鱼寄生后分别暂养在淡水及1.2‰水体中, 每缸暂养10尾鱼, 分别以未寄生幼虫组作为对照, 观察试验鱼的成活情况, 统计死亡鱼体鳃丝寄生幼虫数量。

1.3　钩介幼虫寄生包囊形成过程观察

在钩介幼虫寄生后的4h、24h、48h和72h, 分别剪取眼斑拟石首鱼的鳃丝, 0.02 mg/LPBS冲洗2—3次, 2.5%戊二醛(pH 7.2)固定, 用于扫描电镜观察。电镜样品制备方法同上。

表 1　紫黑翼蚌钩介幼虫寄生用鱼的基本信息Tab. 1　Information of fish species for parisization of glochidia in pink heelsplitter

2　结果

2.1　紫黑翼蚌原产地4种鱼寄生后幼虫早脱落情况

4种鱼在寄生后的10d内幼虫早脱落情况如表3。其中5尾淡水石首鱼早脱落的幼虫在272—854只,寄生第1至第2天内为幼虫脱落的高峰, 占早脱落幼虫总数的93.5%—98.3%, 形态观察表明大部分幼虫为闭合状态, 但外壳前后端边缘有新的透明组织生长(图版Ⅰ-A); 第4至第10天内脱落的幼虫数量占脱落总数的1.7%—6.5%, 第4d幼虫外壳边缘生长更为显著(图版Ⅰ-B), 而第10天脱落的幼虫外壳的大小和形态与完全变态稚蚌相似, 但尚不能爬动。在寄生第2天, 检查蓝鲶、牛头鲶和小口鲈的鳃丝发现：钩介幼虫已全部从3种鱼体脱落, 但从蓝鲶和小口鲈脱落的幼虫均死亡, 内脏多腐烂成空壳; 而从牛头鲶脱落的幼虫多为闭合而存活。

2.2　淡水石首鱼寄生幼虫变态率

寄生在5尾淡水石首鱼上脱落稚蚌的数量如表4所示。在水温20—22℃条件下, 寄生第11天可见完成变态脱落的稚蚌, 可伸出斧足爬动(图版Ⅰ-C、D)。5尾寄生鱼在寄生的第17至第23天内陆续出现死亡, 检查了FD3、FD4、FD5鱼体上尚未脱落的钩介幼虫数量, 分别为70、60、95只。推测紫黑翼蚌寄生稚蚌脱落的高峰出现在第21至第23天。FD3、FD4、FD5的寄生幼虫变态率分别为42.85%、60.37%和45.65%。

2.3　国内替代寄主鱼的筛选

第1次寄生试验结果显示： 在寄生后3d内, 黄颡鱼、尼罗罗非鱼、红罗非鱼、沙塘鳢、鲫、黄金鲈及暗纹东方鲀鳃丝上的幼虫全部脱落, 而7种鱼寄生后30d内未收集到变态稚蚌, 寄生鱼的成活率均为100%。对刚寄生的尼罗罗非鱼鳃丝上黏附幼虫计数为(396±30)只/尾(n=3)。检查7组寄生鱼前2d幼虫脱落情况发现： 黄颡鱼寄生脱落的幼虫全部开壳死亡, 而其他6组脱落幼虫80%幼虫为双壳闭合状态。试验结果表明： 这7种鱼均不能作为紫黑翼蚌的替代寄主鱼。

表 2　紫黑翼蚌替代寄主筛选实验用鱼基本信息Tab. 2　Information of fish species selected forhost fish of pink heelsplitter

表 3　紫黑翼蚌钩介幼虫从4种鱼类上早脱落数量统计Tab. 3　The number of glochidia in pink heelsplitter early detached from 4 different kinds of fish

表 4　淡水石首鱼脱落稚蚌数量统计Tab. 4　The number of juvenile mussel detached from freshwater drum

第2次寄生试验结果显示： 寄生于鲤、鳜鳃丝的钩介幼虫在48h内全部脱落, 在寄生30d内未出现死亡, 也未收集到变态稚蚌; 而淡化至5‰的11尾眼斑拟石首鱼在寄生第3、第5、第8天及第11天逐步死亡。检查存活11d的1尾眼斑拟石首鱼, 发现其鳃丝上仍有156只幼虫寄生。初步结果表明： 眼斑拟石首鱼具有作为紫黑翼蚌替代寄主鱼的潜力, 但可能由于淡化不完全, 且寄生后的应激反应导致眼斑拟石首鱼出现较高的死亡和钩介幼虫大量脱落。

根据盐度对紫黑翼蚌钩介幼虫试验结果, 第3次采用淡化至1.2‰的眼斑拟石首鱼进行寄生, 结果显示： 暂养在淡水中的未寄生组眼斑拟石首鱼在16h死亡率达到50%, 72h全部死亡, 而暂养在1.2‰盐度组的幼鱼成活率为100%, 这表明淡水的低渗应激是眼斑拟石首鱼高死亡的主要因素。对于寄生组, 暂养在淡水中4h即有70%的幼鱼死亡,至16h死亡率达到100%; 而暂养在1.2‰盐度水体中, 16h死亡率低于淡水中, 但至72h也全部死亡, 检查鳃丝发现寄生幼虫的数量为68—149只/尾。初步结果表明： 钩介幼虫寄生及淡水胁迫仍是导致眼斑拟石首鱼死亡的主要因素。

2.4　钩介幼虫寄生鳃组织包囊形成观察

在第2次寄生试验中, 对暂养淡水中的大规格眼斑拟石首鱼的鳃丝扫描电镜观察表明： 在寄生第1天, 幼虫依靠腹部一对壳钩机械入侵寄生鱼的鳃丝, 对鳃组织造成较大的损伤, 有的鳃丝甚至被夹而断裂(图版Ⅱ-A), 在幼虫表面可见寄生鱼的红细胞等渗出物(图版Ⅱ-B、C); 寄生鱼的鳃丝表面覆盖不规则多边形的鳃丝上皮细胞, 表面具有明显的类同心圆褶皱分布(图版Ⅱ-D); 鳃丝细胞从幼虫入侵部位开始迁移上包, 逐步形成包囊(图版Ⅱ-E), 部分幼虫的包囊基本形成, 仅见幼虫背部(图版Ⅱ-F);至第2天, 鳃丝上幼虫全部形成包囊(图版Ⅱ-G), 包囊与幼虫入侵的鳃丝组织连成一体(图版Ⅱ-H), 包囊表面的细胞与鳃丝上皮组织细胞相似, 细胞表面均具有不甚规则的同心圆螺纹, 而内部由多层薄膜组成(图版Ⅱ-I)。此外, 观察发现在第11天收集到脱落的幼虫双壳边缘已出现了明显的生长。

在第3次寄生试验中, 对淡化至1.2‰的眼斑拟石首鱼幼鱼鳃丝组织扫描电镜显示： 在寄生4h内,钩介幼虫机械入侵幼鱼鳃丝, 其方式与成鱼有所不同, 但均未形成包囊(图版Ⅲ-A); 至寄生第3天, 仍有部分幼虫表面未形成包囊(图版Ⅲ-B), 但边缘出现一定生长(图版Ⅲ-C); 部分幼虫在与鳃丝接触的部位, 鳃丝上皮细胞向幼虫背部逐步迁移形成包囊(图版Ⅲ-D), 也有幼虫表面包囊已经全部形成(图版Ⅲ-E), 包囊外部仍可清晰发现幼虫绞合部轮廓(图版Ⅲ-F)而在团头鲂寄生组未发现变态雅蚌。

3　讨论

3.1　钩介幼虫的寄生选择性和变态率差异

蚌类钩介幼虫不仅对寄主鱼的选择性存在较大差异, 而且在不同寄主鱼上的变态率也存在显著差异。世界性分布的种类如无齿蚌属多为广泛性寄生的种类, 如背角无齿蚌(Anodonta woodiana woodiana)可寄生在多种鱼类上完成变态发育, 但在不同寄主鱼上的幼虫变态率仍存在显著差异： 在罗非鱼、黄颡鱼、鳙(Aristichthys nobilis)、鲤上的寄生变态率依次为61.8%、34.7%、33.1%和15%,罗非鱼组显著高于其他3种寄主鱼[10]。对于专一性寄生的种类, 其寄生变态率差异更大： 绢丝丽蚌(Lamprotula fibrosa)钩介幼虫寄生在鲢(Hypophthalmichthys molitrix)上的稚蚌变态率和脱落数量为11.26%、16.31只/尾, 鳙为6.72%、21.7只/尾, 鲫为0.35%、21.7只/尾, 黄颡鱼为61.62%、136.43只/尾, 草鱼(Ctenopharyngodon idellus)为31.19%、256.46只/尾[11]; 而淡水蚌(Lampsilis fasciola)在3种寄主鱼——小口黑鲈、大口黑鲈(M. salmoides)和斑点杜父鱼(Cottus bairdi)上寄生变态率分别为(82±2)%、(63±8)%和(37±7)%[12]。本文选取了鲈形目、鲶形目、鲀形目及鲤形目共16种鱼类进行紫黑翼蚌寄主鱼的筛选, 结果表明： 紫黑翼蚌是目前发现对寄主鱼选择性最为专一的蚌类之一, 淡水石首鱼是其特定的寄主鱼, 这与已有的研究结果一致[6—9]。

变态率和变态稚蚌的数量是评价蚌类优良寄主鱼的两个重要指标, 不仅受到寄主鱼的种类影响,而且受到幼虫的寄生密度[11]、寄主鱼规格[13]、生理状态及养殖方式[8,14]等影响。在蚌类的人工育苗生产中, 不仅要筛选出合适的寄主鱼种类, 更要选择适宜的寄主鱼规格、寄生密度, 提高寄生效率和降低生产成本, 形成简便易行的育苗技术工艺, 从而实现苗种的规模化繁育。

本文首次评估了紫黑翼蚌在淡水石首鱼上的寄生变态率, 在42.9%—60.4%, 变态稚蚌的数量在319—797只/尾。Hua[8]研究表明： 寄生在大规格淡水石首鱼上的紫黑翼蚌变态稚蚌数量为34—85只/尾, 而小规格为51—260只/尾, 小规格淡水石首鱼寄生效果要好于大规格, 推测大规格的野生鱼可能受到自然水体中的幼虫寄生而产生了免疫抵抗力有关; 而过量的寄生(1415—5426只/尾)容易导致淡水石首鱼的死亡。本研究中淡水石首鱼的寄生幼虫总数在674—1651只/尾, 高于Hua[8]建议的安全寄生量, 因此出现较高的寄生死亡率。而寄生胁迫对淡水石首鱼鳃丝的机械损伤巨大, 且变态发育过程需要汲取鱼体大量的营养从而加剧了寄主鱼的死亡。

目前, 关于蚌类对寄主鱼的选择性机制尚不清楚, 但普遍认为鱼类的天然免疫起了重要防御作用[15,16]。钩介幼虫寄生到非寄主鱼体后, 鱼体的黏液免疫细胞、免疫因子等发生防御反应。本研究发现： 在蓝鲶和小口鲈寄生2d内脱落的幼虫均死亡, 而牛头鲶寄生脱落的幼虫均闭合, 这与黄颡鱼寄生试验有相似之处, 推测这3种试验鱼体中存在某些紫黑翼蚌钩介幼虫的致死因子, 但有待进一步的研究。

3.2　寄生包囊形成差异及替代寄主鱼潜能评估

蚌类钩介幼虫在寄主鱼组织机械入侵寄生后,通过上皮细胞迁移在幼虫表面覆盖形成包囊, 从而完成寄生过程[17—19]。在寄生包囊形成期, 上皮细胞线粒体出现膨胀、染色质变得致密和深染[16], 并出现板状伪足利于在幼虫表面迁移[19]。在淡水珍珠蚌(Margaritifera margaritifera)寄生初期的包囊厚度约为15 μm, 但后期逐渐变薄[21]。幼虫在包囊内完成变态发育成稚蚌破囊脱落。

不同钩介幼虫在寄主鱼上形成包囊的时间存在较大差异： 淡水珍珠蚌(M. margaritifera)在寄生大西洋鲑(Salmo salar)后9—12h内形成包囊[17]; 在冬季繁殖期, 绢丝丽蚌钩介幼虫寄生在草鱼、鳙和黄颡鱼3种宿主鱼3d后才开始形成包囊, 但包囊还不明显, 且不同寄生鱼上的包囊大小在发育不同时期并无显著差异[21]; 在水温(25±1)℃条件下, 背瘤丽蚌(L. leai)钩介幼虫在寄生后5h, 在鳃丝、鳍条和须上大部分形成包囊, 至第2天完全被包囊包裹[22]。这种差异可能与蚌的种类、寄主鱼种类及养殖水温等有关。另一方面, 同种蚌类钩介幼虫在不同寄主鱼上形成包囊的时间也存在明显差异： 淡水蚌类(Utterbackia imbecillis)在优良寄主鱼——蓝鳃太阳鱼(Lepomis macrochirus)上寄生后130min形成完整包囊, 而在变态率较低的寄主鱼——大口黑鲈、金鱼(Carassius auratus)上形成完整包囊的时间约为230min。此外, 在首次寄生的寄主鱼、寄生过的寄主鱼和非寄主鱼体均可以形成包囊, 而后两者形成包囊的速度相对较慢、形成完整包囊的比例低, 且形态异常、厚度较薄, 并显著影响寄生钩介幼虫的变态率[19]。

Neves等[23]认为具有相近进化(亲缘)关系的鱼类可能是同一种蚌的天然寄主鱼。眼斑拟石首鱼,俗称美国红鱼, 与淡水石首鱼同属石首鱼科, 原产于美国东南海岸和墨西哥沿海岸, 1991年由国家海洋局第一海洋研究所引进我国, 它是石首鱼科中唯一的广温、广盐性、溯河性鱼类, 可在淡水中正常生长, 具有生长快、养殖产量高、抗病力强等特点[24],在我国已具有良好的养殖基础。因此, 本文选择了眼斑拟石首鱼开展紫黑翼蚌的寄主鱼筛选。本研究结果表明： 无论是眼斑拟石首鱼大规格鱼还是幼鱼, 寄生在鱼体鳃丝上的幼虫表面均能逐步形成完整的包囊, 这与前期的研究结论一致[17,19,25]; 但在相同水温条件下, 钩介幼虫在大规格的眼斑拟石首鱼鳃丝寄生形成包囊的速度明显快于幼鱼。在寄生第2天, 大规格鱼鳃丝寄生的钩介幼虫已经全部形成包囊, 未形成的可能脱落; 而幼鱼鳃丝寄生的幼虫在第3天仅有部分形成完整的包囊, 但这些幼虫是否会继续形成包囊或脱落还有待进一步的研究。因此, 寄生包囊的形成可能也受到鱼体规格、生理状态及养殖水体盐度等影响。

在眼斑拟石首鱼鳃丝寄生11d的钩介幼虫边缘出现了明显生长, 这与寄生在淡水石首鱼上和笔者在体外培养条件下变态发育的幼虫形态相似, 进一步表明眼斑拟石首鱼具有作为紫黑翼蚌替代寄主鱼的潜能, 与Hua[8]的研究结果一致。紫黑翼蚌钩介幼虫为斧头形, 腹缘具有2对巨大的壳钩, 对寄生鱼鳃丝会造成巨大的机械性损伤, 这种损伤显然要大于其他有钩型或无钩型的钩介幼虫。寄生后大规格的眼斑拟石首鱼成活时间要显著长于幼鱼, 这可能与寄生鱼的年龄、健康状态及寄生数量等有关。由于幼鱼的鳃丝明显比成鱼细小, 钩介幼虫更容易侵袭其鳃丝。提示应开展眼斑拟石首鱼的人工驯养和淡化研究, 选用适宜的鱼体规格并控制好寄生量, 提高寄生鱼的成活率。

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图版 Ⅰ　紫黑翼钩介幼虫的寄生变态发育观察Plate Ⅰ　Parisize metamorphosis of glochidia in pink heelsplitter

图版Ⅱ　紫黑翼蚌钩介幼虫在大规格眼斑拟石首鱼鳃组织寄生包囊形成过程PlateⅡ　Process of cyst formation after pink heelsplitter glochidia parasited on the gill in red drum with larger size

图版Ⅲ　紫黑翼蚌钩介幼虫在眼斑拟石首鱼幼鱼鳃组织寄生包囊形成过程PlateⅢ　Process of cyst formation after pink heelsplitter glochidia parasited on the gill in juvenile red drum