水流动力学注射对小鼠肝损伤及肝脏的自然修复作用

李胜男，张海英，孙千惠，李艳茹，葛　鹤，杜　瑜，王　琳

(吉林大学基础医学院病理学系 病理生物学教育部重点实验室， 吉林 长春 130021)

水流动力学注射(hydrodynamic injection)是将大体积(占小鼠体质量的8%～10%)质粒DNA溶液经小鼠尾静脉在5～8 s内快速注射入小鼠体内，进而获得转基因表达的方法，通常转基因在肝脏表达最多[1]。除DNA外，已成功应用此方法将RNA、蛋白甚至病毒等转移到动物体内，广泛应用于基因功能测试、基因治疗等研究以及病毒性肝炎模型的制备等[2-3]。由于静脉注射的大体积质粒DNA溶液迅速进入体循环，使心脏负荷过重，导致大量的液体淤积在肝脏，肝内压力升高，迫使肝窦内皮细胞窗增大，肝细胞膜出现暂时性小孔，质粒DNA进入肝细胞，进而表达目的基因[4]。此方法产生的压力将基因送入肝细胞的同时，也可能引起肝窦内皮细胞和肝细胞损伤。但是关于肝脏的形态学改变的研究[5]极少，其修复过程尚不清楚。本研究通过水流动力学注射法制备小鼠肝损伤模型，观察肝脏在损伤及修复过程中的形态学变化，检测与修复有关的因子，为更好地利用此方法进行科学研究提供依据，为进一步探讨水流动力学注射性肝损伤的修复机制奠定基础。

1　材料与方法

1.1实验动物和肝损伤模型制备31只雌性Balb/c小鼠，体质量为18～20 g，购自吉林大学实验动物中心，动物许可证号：SCXK(吉)-2003-0001。用26 G针头将小鼠体质量10%的生理盐水(1.8～2.0 mL)在3 s内经尾静注射入小鼠体内。按照注射后时间点将小鼠分为5组：30 min组、8 h组、1 d组、3 d组和7 d组，每组5只。以6只未注射小鼠为对照组，记为0 min组。

1.2各组小鼠血清丙氨酸氨基转移酶(alanine transaminase，ALT)测定注射生理盐水后，于不同时间点经内眦静脉取血，按照ALT试剂盒(上海科华-东菱诊断用品公司)说明检测血清ALT水平。

1.3肝脏形态学观察分别于注射后不同时间点处死小鼠并称体质量。取肝脏观察大体改变，制备石蜡切片，经苏木精-伊红(HE)染色，显微镜下观察病理学改变。为了确定肝脏病理学改变的区域，根据参考文献[5]将围绕门静脉周围的肝细胞区域定为门静脉区，即1区；围绕在中央静脉周围的肝细胞区域定为中央静脉区，即3区；介于二者之间的肝细胞区域为2区。每只小鼠分别选取10个有代表性的区域，统计每高倍视野下的肝细胞数及双核细胞数。

1.4免疫组织化学染色上述制备的石蜡切片，利用免疫组织化学染色(SP法)观察增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)的表达情况。一抗为鼠抗人PCNA单克隆抗体(福州迈新，1∶300)，二抗为羊抗鼠/兔IgG(福州迈新)，DAB溶液显色，苏木精复染。以PBS代替一抗作为阴性对照。PCNA阳性表现为细胞核呈棕黄色。每只小鼠肝组织切片内分别选取10个视野，计算肝细胞及胆管细胞PCNA阳性细胞百分数，将其作为PCNA指数。

1.5Real-time PCR法检测基因表达水平按照RNAiso Plus(日本TaKaRa公司)说明书提取肝组织总RNA；根据Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)(日本TaKaRa公司)说明书进行逆转录反应(RT)，按照FastStart Universal SYBR Green Master (ROX) (瑞士Roche公司)说明书进行Real-time PCR法检测，利用ABI 7300实时荧光定量PCR仪(美国 ABI公司)检测各组小鼠肝组织中肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素6(interleukin-6，IL-6)、表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)、转化生长因子α(transforming growth factor-α，TGF-α)、Cyclin D1、血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、Bax和Bcl-2 mRNA表达水平，基因相对表达水平以2-ΔΔCt表示，其中ΔΔCt=(实验组Ct目的基因-实验组Ct内参基因) -(对照组Ct目的基因-对照组Ct内参基因)。以m-Arbp和β-actin为内参，引物设计见表1。

表1　引物序列

2　结　果

2.1各组小鼠肝脏大体改变和血清ALT水平水流动力学注射后，小鼠抽搐、呼吸急促，数秒钟后恢复正常；体质量增加约10%，8 h后体质量恢复。与对照组(0 min组)比较，30 min组小鼠肝质量/初始体质量比无明显变化，8 h组明显下降(P<0.05)，1 d 组和7 d组差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。对照组小鼠肝脏呈灰白色，表面无出血点；30 min组小鼠肝脏呈灰红色；8 h组小鼠肝脏表面出现黑红色片状出血区；1 d组小鼠肝脏表面仍可见片状出血区；3 d组小鼠出血区面积减小；7 d组小鼠肝脏呈灰白色，与对照组相似。见图1(插页四)。30 min组和8 h组小鼠血清ALT水平明显低于对照组(P<0.01)，1 d组明显高于对照组(P<0.01)，7 d组差异无统计学意义(P>0.05)。

表2各组小鼠肝质量/初始体质量比值和血清ALT水平

GroupRatioofliverweight/originalbodyweightALT[λB/(U·L-1)]Control　(0min)0．064±0．01027．00±2．9630min0．065±0．0063．40±1．82∗∗8h0．049±0．005∗3．00±1．58∗∗1d0．064±0．005250．50±62．69∗∗3d0．063±0．00347．80±7．397d0．077±0．00529．20±5．26

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group.

2.2肝组织形态学表现对照组(0 min组)小鼠肝小叶结构完整，肝细胞以中央静脉为中心，沿肝细胞索呈放射状排列，肝窦清晰。30 min组小鼠出现大量肿胀的肝细胞，胞质淡染，成群分布，主要位于1区和2、3区之间；此外，肿胀区域内可见小面积出血，肝细胞索被破坏；每高倍视野下肝细胞数明显少于对照组(q=4.760，P<0.05)。见图2(插页五)和表3。8 h组小鼠肿胀细胞数量较30 min组明显减少，而出血更加明显，肝细胞、肝窦内皮细胞被破坏，可见红细胞进入肿胀的肝细胞内，在出血坏死灶周围未受损区域内可见双核肝细胞及核分裂象(图2，见插页五)；与30 min组比较，肝细胞数明显增多(q=7.310，P<0.01)，双核细胞数也明显增多(q=7.200，P<0.01)。1 d组出血坏死灶面积减小(图2，见插页一)，肝细胞数明显少于8 h组(q=4.966，P<0.05)，双核细胞数也明显少于8 h组(q=6.596，P<0.01)，但是二者与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。3 d组除靠近肝脏表面处有个别出血灶外，肝实质内出血坏死灶基本消失，肝细胞数及双核细胞数与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。7 d组肝组织结构与对照组相似，肝细胞、双核细胞数量与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。所有时间点均未见胆管上皮细胞的破坏。

表3每高倍视野下各组小鼠肝组织内细胞数量

GroupNo．ofhepatocytesNo．ofbinuclearhepatocytesControl(0min)78．5±7．69．4±3．230min65．4±10．0∗7．6±2．68h88．0±9．7△15．2±3．3△1d71．4±2．0#7．8±0．9##3d78．0±3．76．7±0．67d77．4±3．37．6±0．7

*P<0.05vscontrol group;△P<0.01vs30 min group;#P<0.05,##P<0.01vs8 h group.

2.3各组小鼠肝组织PCNA表达免疫组织化学染色结果显示：PCNA阳性肝细胞主要位于2、3区受损区域周围。8 h组PCNA指数较对照组升高(t=4.458,P<0.01)，1 d组最高，且明显高于对照组(t=15.557,P<0.01)，7 d组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。30 min组汇管区胆管细胞PCNA指数明显高于对照组(t=3.985,P<0.01)，随后降低，7 d组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。

2.4各组小鼠肝组织中多种因子的表达30 min组小鼠肝组织中TNF-α mRNA水平明显高于8 h组(q=4.952，P<0.05)；8 h组仍高于7 d组(q=8.461，P<0.01)。30 min组小鼠肝组织中IL-6 mRNA水平明显高于8 h组(q=14.750，P<0.01)，8 h组明显高于7 d组(q=6.923，P<0.01)。30 min组各组小鼠肝组织中EGF mRNA 水平明显高于8 h组(q=14.750，P<0.01)。3 d组各组小鼠肝组织中HGF mRNA 水平明显高于30 min 组和8 h组(q=5.031，P<0.05；q=4.631，P<0.05)。8 h组和3 d组TGF-α mRNA水平均明显高于30 min 组(q=4.592，P<0.05；q=8.137，P<0.01)。8 h和1 d组Cyclin D1 mRNA水平均明显高于7 d组(q=4.736，P<0.05；q=5.213，P<0.05)。30 min组各组小鼠肝组织中VEGF mRNA水平明显高于8 h组(q=13.551，P<0.01)。1 d组Bax/Bcl-2 mRNA 比值明显高于30 min组(q=5.731，P<0.01)。见表4。

3　讨　论

肝再生主要是由残存的健康成熟肝细胞通过增殖完成[6]，除肝细胞外，胆管细胞能够通过TNF-α、IL-6和VEGF等因子的释放对组织损伤做出反应，并在上述因子的调节下，进行与胆管修复有关的增殖、凋亡以及血管生成[7]。另外，Kupffer细胞、肝星形细胞和肝窦内皮细胞可通过分泌多种细胞因子而参与肝再生，如TNF-α、IL-6以及VEGF等[8]。本实验中，注射后30 min，肝细胞数明显少于对照组，这是由于此时肝细胞肿胀、体积增大，导致单位面积内细胞数减少所致[5]；注射后8 h肝细胞数以及双核细胞数明显多于30 min，肝细胞PCNA指数也明显高于30 min，这些增多的肝细胞可能是为了维持肝脏功能而产生。注射后8 h，出现弥漫的片状出血坏死灶，说明此时肝窦内皮细胞受到破坏，但是在注射后7 d，出血坏死消失，肝组织结构恢复正常。胆管细胞PCNA指数在注射后30 min高于其他时间点。以上结果说明：在水流动力学注射引起的肝损伤中，肝细胞、胆管细胞和肝窦内皮细胞均参与了肝组织修复。

图3　各组小鼠肝组织PCNA指数

Fig.3PCNA indexes in liver tissue of mice in various groups

表4各组小鼠肝组织中肝再生相关因子的mRNA相对表达水平

GroupTNF⁃αIL⁃6EGFHGFTGF⁃αCyclinD1VEGFBax/Bcl⁃230min3．43±1．1813．45±3．091．81±0．470．39±0．080．42±0．121．28±0．252．05±0．110．50±0．178h1．48±0．40∗1．36±0．32∗∗0．93±0．28∗∗0．42±0．240．88±0．27∗1．82±0．650．69±0．28∗∗0．94±0．421d0．68±0．140．95±0．411．00±0．080．48±0．180．82±0．282．02±0．851．00±0．231．36±0．38∗∗3d0．60±0．170．57±0．230．97±0．260．84±0．31∗△1．52±0．75∗∗1．29±0．72#1．37±0．190．80±0．287d0．40±0．15△△0．46±0．07△△0．88±0．440．74±0．100．79±0．170．77±0．37△#1．17±0．140．68±0．32

*P<0.05,**P<0.01vs30 min group;△P<0.05,△△P<0.01vs8 h group;#P<0.01vs1 d group.

本实验中，小鼠在水流动力学注射后30 min及8 h肝组织出现肝细胞肿胀、肝细胞坏死及出血，因肝细胞坏死导致8 h 时肝质量/初始体质量比下降，ALT释放入血，但是因为体内注射了大量的液体，导致ALT浓度被稀释，使测得的30 min及8 h组血清ALT值明显低于对照组。注射后8 h，肝组织坏死的同时，肝细胞开始大量增殖，表现为肝细胞(含双核肝细胞)数量增加。1 d时，注射的液体已经被机体排出，1 d组小鼠血清ALT达到峰值，此时肝组织内出血、坏死灶明显减少，肝质量/初始体质量比也恢复到对照组水平，肝细胞数也与对照组相似。到注射后3 d，ALT水平、肝细胞数、PCNA指数均与对照组无差别，肝脏组织结构基本恢复正常。这与Budker等[5]的研究结果基本一致，即损伤快速出现、快速消退。

目前研究[9]认为：急性肝损伤时肝脏的再生是一个快速发生的过程，主要包括启动期、增殖期和终止期。在启动阶段，有多种细胞因子和生长因子参与调控，其中TNF-α和IL-6使肝细胞由G0期进入G1期。在四氯化碳(CCl4)诱导的肝损伤模型中，TNF-α和IL-6 mRNA表达水平在CCl4处理后1 d最高；使用TNF-α抗体或者敲除TNF-α受体(TNFR1)导致TNF-α耗尽或缺失均会引起肝再生障碍，并且这与NF-κB和STAT3活化受阻从而不能诱导IL-6的表达有关[8]。肝切除后，TNF-α与非实质细胞，尤其是Kupffer细胞的受体结合，激活NF-κB信号通路产生IL-6，IL-6与肝细胞上的IL-6受体结合，激活肝细胞内STAT3以及ERK1/2信号通路，随后进行DNA复制，完成肝再生[10]。TNF-α和EGF联合可促进肝再生过程中的DNA复制。在增殖阶段，HGF、TGF-α和EGF等促有丝分裂原可通过 Ras-MAPK 和PI3K/AKT信号通路促进肝细胞DNA合成和细胞增殖[8]。EGF与EGFR结合后，通过促进Cyclin D1表达调节肝细胞增殖[11]。VEGF能够促进血管生成。在肝切除模型中，VEGF可以通过肝窦内皮细胞增殖，重建肝窦，促进肝细胞增殖。Bockhorn等[12]研究发现：肝切除后24 h，VEGF处理组肝细胞增殖极高，而VEGF抗体处理组肝细胞增殖几乎被完全抑制；VEGF通过与VEGFR结合刺激肝窦内皮细胞增殖，并释放IL-6和HGF，从而参与肝脏的修复。凋亡在肝脏的再生和终止阶段发挥作用[13-15]。

本实验中，注射后30 min时TNF-α、IL-6、EGF和VEGF mRNA表达水平明显升高，而Bax/Bcl-2比值较低。8 h时TNF-α和IL-6仍很高，此时Cyclin D1 也升高。1 d时Cyclin D1和Bax/Bcl-2比值较高，3 d时HGF和TGF-α水平较高。本文作者推测：在水流动力学注射造成肝损伤后，快速升高的TNF-α和IL-6启动了修复的过程，使肝细胞从G0期进入G1期；EGF通过Cyclin D1使肝细胞进入增殖阶段，VEGF促进肝窦内皮细胞增殖和肝窦的修复；而后期的修复停止，可能是由促凋亡的Bax基因以及HGF和TGF-α共同发挥作用完成的。

综上所述，水流动力学注射可引起急性肝损伤，主要表现为肝细胞肿胀并形成出血、坏死灶，肝损伤后可迅速启动修复过程，损伤可在1周左右通过细胞增殖自然修复；与肝再生有关的多种细胞因子和生长因子参与修复过程，但是具体机制仍有待于进一步研究。

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