响应面分析法优化酶提取土茯苓多糖工艺※

郑朝阳　肖兰华　覃　军

土茯苓（Rhizoma Smilacis Glabrae） 为百合科植物光叶菝葜的干燥根茎。其味甘、淡，性平，有解毒，除湿，通利关节的功效，主要用于治疗湿热淋浊，带下，瘰疬，疥藓，梅毒及汞中毒引起的肢体拘挛，筋骨疼痛[1-2]。土茯苓多糖为土茯苓重要活性成分之一，其药理作用广泛，具有抗氧化、抗肿瘤、免疫调节、抗炎等生物活性，有很好的药用价值。目前，对土茯苓多糖的提取方法主要有热水煎煮，碱浸提法，酶提取法等。酶法提取条件温和，简单，可以更快速地得到活性不被破坏的粗多糖，且加入的反应试剂较少，减少环境污染。因此，近年来，酶提取法受到了广泛的关注。但目前对中药多糖的提取多用纤维素酶，对其他酶的研究较少，为更高效的提取多糖，本次实验将通过比较不同酶类提取的土茯苓多糖得率，筛选最佳酶，利用响应面法优化最佳酶提取土茯苓多糖，单因素实验研究酶解时间、酶解pH、酶用量这三个因素对土茯苓多糖得率的影响，为建立更高效的土茯苓多糖提取工艺和后续的发展提供可靠的理论基础与科学依据。

1　材料与仪器

1.1仪器 旋转蒸发器（上海申生科技有限公司）；BT125D型十万分之一电子天平和BS224S型万分之一电子天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）；U-2910型紫外双光束分光光度计（日本日立公司）；恒温水浴锅（上海精宏公司）；B600A型低速离心机（白洋公司）。

1.2药材及试剂 土茯苓药材饮片（康美药业股份有限公司，批号：170349316）；植物精提002酶、纤维素酶（宁夏夏盛实业基团有限公司）；中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶（南宁庞博生物工程有限公司）；浓硫酸、苯酚、冰乙酸、D(+)Glucose等均为分析纯，水为蒸馏水。

2　研究方法

2.1多糖提取方法 将土茯苓用粉碎机粉碎，过80目筛，称取1.0 g土茯苓粉末于50 mL锥形瓶中，酶用量0.5%，50℃水浴酶解2 h，料液比1∶35，pH为5条件下提取土茯苓多糖。酶解结束沸水灭酶5 min，离心10 min（r=4000 r/min），去除可沉淀的杂质，取上清液。

2.2土茯苓多糖含量的测定

2.2.1葡萄糖标准曲线的绘制 精密称定100 mg葡萄糖标准品，加水溶解并定容至100 mL，制成葡萄糖标准溶液。精密吸取葡萄糖标准液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL于100 mL容量瓶中，加水定容，配制成浓度为0.01 mg/mL、0.02 mg/mL、0.03 mg/mL、0.04 mg/mL、0.05 mg/mL的葡萄糖溶液。各精密吸取2 mL于10 mL试管中，加入1 mL 5%苯酚溶液，混匀，再立即加5 mL浓硫酸。放置冷却，以相应试剂为空白，于490 nm处测量。以吸光度值（A） 为纵坐标，葡萄糖质量（C）为横坐标，求其标准曲线。

2.2.2土茯苓多糖含量的测定取2.1中上清液适量置100 mL容量瓶中，加水定容。将其稀释至合适浓度，于490 nm处测吸光度，通过标准曲线计算样品中多糖得率。

式中C为由葡萄糖标准曲线计算得出的浓度，D为稀释度，0.9为葡萄糖转化为葡聚糖的转换系数，M为土茯苓原料质量。

2.3单一酶解法提取土茯苓多糖的试验 称取土茯苓粉末6份每份1 g，置于50 mL锥形瓶，其中5份样品分别加入不同种类的酶。其他条件相同，按2.1项下进行试验，比较多糖得率。

2.4土茯苓多糖提取工艺的优化

2.4.1单因素试验 在2.3的基础上，选取提取土茯苓多糖最高的酶进行单因素试验，分别考察酶解时间，酶解pH，酶用量对土茯苓多糖提取率的影响。

2.4.2响应面试验设计 在单因素试验的基础上，设计三因素三水平的响应面分析试验，以酶解时间、酶解pH、酶用量为自变量，多糖得率为响应值指标，采用Design-Expert 8.0软件设计三因素三水平响应面实验方案，并用其进行数据处理，以确定土茯苓多糖的最佳提取条件，因素编码表见表1。

表1　Box-Behnken实验设计因素与水平的编码

2.5结果与分析

2.5.1苯酚-硫酸法葡萄糖标准曲线 以葡萄糖为标准品，按照2.2.1所述方法实验。以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线如图1所示。标准曲线的回归方程为：A=8.84c-0.013，R2=0.9991，表明吸光度在葡萄糖浓度为0.01~0.05mg/mL范围内呈良好的线性关系。

图1　葡萄糖标准曲线

2.5.2五种酶的比较 由图2可知，同等提取条件下，加酶可以显著提高土茯苓多糖得率，纤维素酶，中性蛋白酶，木瓜蛋白酶三者的多糖提取率都较高，其中木瓜蛋白酶的提取效果最好。最终选用木瓜蛋白酶为本次实验用酶。

图2　酶种类的影响

2.5.3单因素实验结果及分析

2.5.3.1酶解时间对多糖提取率的影响 精确称量5份土茯苓粉末各1 g，置于50mL锥形瓶。提取时间分别为60 min、90 min、120 min、150 min、180 min，水浴温度50℃，酶用量0.5%，料液比为1∶35。酶解结束后，加水稀释至100 mL，离心10 min（r=4000 r/min），取上清液1 mL加入100 mL容量瓶，定容。精密移取各样品溶液2 mL，苯酚-硫酸法于490 nm测定吸光度，计算多糖含量，结果见图3。

图3　酶解时间对多糖得率的影响

由图3可知，随着酶解时间的延长，多糖提取率上升。但当酶解时间超过150 min后，多糖提取率下降，这可能是由于酶解时间过长从而导致了多糖结构的改变或者是糖苷键的裂解，因此选择最佳酶解时间为150 min。

2.5.3.2酶解pH对多糖提取率的影响 精确称量6份土茯苓粉末各1 g，置于50 mL锥形瓶。提取pH分别为4、5、6、7、8、9，水浴温度50℃，酶用量0.5%，酶解时间为120 min，料液比为1∶35。酶解结束后，加水稀释至100 mL，离心10 min（r=4000 r/min），取上清液1 mL加入100 mL容量瓶，定容。精密移取各样品溶液2 mL，苯酚-硫酸法于490 nm测定吸光度，计算多糖含量，结果见图4。

图4　酶解p H对多糖得率的影响

酶的活性和稳定性均受pH的影响，pH过高或过低都会降低酶的活性，影响酶的稳定性，降低酶的催化作用。从而影响土茯苓多糖的提取率。由图4可知，本次实验最佳酶解pH为8。

2.5.3.3酶用量对多糖提取率的影响 精确称量6份土茯苓粉末各1 g，置于50 mL锥形瓶。水浴温度50℃，酶用量分别为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%，酶解时间为120 min，料液比为1∶35。酶解结束后，加水稀释至100 mL，离心10 min（r=4000 r/min），取上清液1 mL加入100 mL容量瓶，定容。精密移取各样品溶液2 mL，苯酚-硫酸法于490 nm测定吸光度，计算多糖含量，结果见图5。

图5　酶用量对多糖得率的影响

由图5可见，随着酶用量的增加，多糖提取率增大，当酶用量为0.5%时达到峰值，之后再增大酶用量，多糖提取率不再增加。这是因为当酶的用量上升到一定浓度之后达到饱和，此时没有多余的底物再有机会与酶反应。

2.5.3响应面法优化工艺

2.5.3.1响应面分析方案与结果 根据单因素实验的结果，选取酶解时间、酶解pH、酶用量3个因素为自变量，以多糖得率为因变量，采用响应面法设计三因素三水平实验方案，共有15组实验，其中12组为析因实验，3组为中心实验以估计误差。响应面试验结果如表2所示，回归分析结果如表3所示。一般模型项（Model）反应实验数据与模型相符情况，失拟项反映了实验数据与模型不相符的情况。由上表可以看出，响应面模型高度显著（P<0.0001），显示差异有统计学意义；失拟项的P值为0.4178（P>0.05），说明该模型的拟合度较好，可以采用该模型确定最佳酶法提取土茯苓多糖的最佳条件。同时，该模型的R2=0.9944表示多糖提取率有99.44%的影响的变化来自于所选变量。一次项B、C和二次项A2、B2、C2都对土茯苓多糖提取率影响显著；二次项AC较为显著。在选取的因素水平范围内，各因素对土茯苓多糖的影响大小次序为：B-pH>C-酶解时间>A-酶用量。

表2　Box-Behnken实验设计与实验结果

表3　多糖提取率为响应值回归模型方差分析表

2.5.3.2交互项对多糖提取率的响应面三维图分析 图6~8为响应面分析等高线图以及对应的响应面图，可以较为直观地看出任意两个交互项对土茯苓多糖提取率的影响规律。

图6酶用量（A）和酶解pH（B）对土茯苓多糖提取率的影响

图6显示了酶用量和酶解pH对土茯苓多糖提取率的交互影响作用。在酶解时间150 min下，利用曲面图和对应的等高线形状，可以看出随着酶用量和酶解pH的增大，土茯苓的多糖提取率呈现出先增大后减小的趋势。

图7酶用量（A）和酶解时间（C）对土茯苓多糖提取率的影响

图7显示了酶用量和酶解时间对土茯苓多糖提取率的交互影响作用。在最酶解pH为8下，利用曲面图和对应的等高线形状，可以看出随着酶用量和酶解时间的增大，土茯苓的多糖提取率呈现出先增大后减小的趋势。

图8酶解pH（B）和酶解时间（C）对土茯苓多糖提取率的影响

图8显示了酶解pH和酶解时间对土茯苓多糖提取率的交互影响作用。在酶用量为0.5%下，利用曲面图和对应的等高线形状，可以看出随着酶解pH和酶解时间的增大，土茯苓的多糖提取率呈现出先增大后减小的趋势。

2.53.3验证实验 通过Design Expert 8.0.6.1优化后的回归模型对酶法提取土茯苓多糖的条件进行优化，确定了对最佳方案为木瓜蛋白酶的酶用量为0.6%、酶解时间为pH为8.08、150.34 min，在此条件下，可获得较为理想的多糖提取率。考虑到实际可行性操作，最终修正酶法提取土茯苓多糖的条件为：酶用量0.6%、酶解pH为8、酶解时间150 min。根据修正条件对此进行验证实验，样品平行三份，得到多糖提取率为26.31%，与理论值25.71%相比，相对误差为2.33%，与理论值相近，说明拟合效果较好。

3　讨论

酶法提取多糖，可以在温和的条件之下提取多糖，可以更快速地得到活性不被破坏的粗多糖。酶具有微量高效的特点，及少量的酶就可以达到良好的多糖提取效果，避免了化学试剂的浪费。本实验的最优酶为木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶是一种含巯基肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，在土茯苓多糖提取过程中可以使土茯苓中的游离蛋白质发生水解，并进一步水解结合蛋白中的蛋白质，减少它们与土茯苓多糖的结合力，有利于土茯苓多糖的溶出。

本实验采用响应面法优化木瓜蛋白酶提取土茯苓多糖工艺，通过F值得出三个因素对多糖提取率影响顺序为：pH＞酶解时间＞酶用量。两两交互影响的结果来看，酶用量-酶解时间、pH-酶解时间交互项对多糖提取率的影响显著。经单因素和响应面实验，得出木瓜蛋白酶提取土茯苓多糖的最佳工艺为酶用量0.6%，酶解pH为8，酶解时间150 min，酶解温度为50℃，在此条件下得到的实际多糖提取率为26.31%，与预测值25.71%的相对误差为2.33%，表明此设计法用于酶法提取土茯苓多糖的工艺优化可行，为今后能更好的开发和利用土茯苓多糖，可以从以下两个方面开展研究。（1）本实验未对不同比例的酶进行考察，三种酶对提取土茯苓多糖得率都较高，假如三种酶以不同比例混合是不是可以更好的提取土茯苓多糖。（2）未对酶提取多糖的机理进行研究，从酶筛选结果可以看出，纤维素酶，中性蛋白酶和木瓜蛋白酶是提取土茯苓多糖得率较高的三种酶，是不是可以说明蛋白质与土茯苓多糖的结合是主要影响多糖溶出的因素。

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