纳米孔检测磁珠绑定DNA降速过程研究

孔德福

（东南大学机械工程学院，江苏南京210000）

0 引言

自从1996年Kasianowicz[1]用电压驱动的方式实现了α-血溶素通过生物孔，用纳米孔作为传感器分析DNA的序列已经成为一个热门的研究领域。

纳米孔DNA测序方法原理是当DNA分子通过纳米孔的时候，会造成纳米孔的局部堵塞，从而实现过孔离子电流的变化，通过离子电流的变化得到过孔DNA序列的信息。但为了克服DNA的熵阻，要想驱动DNA就必须施加较大的电流，从而会导致DNA的过孔速度过快，使得DNA过孔的时间和空间分辨率降低，噪音增大。所以，降低DNA过孔速度是实现纳米孔测定DNA序列的关键技术。将DNA绑到有孔小珠或磁珠上，通过光镊或磁镊控制小珠，能够实现DNA的降速；利用AFM或其他的纳米级控制，也能够达到降低DNA速率的效果。

本文探究了在磁珠绑定下DNA过孔电流和绑定断裂的情况，在不同的电压下得到了明显的特征信号，据此研究了DNA和磁珠过孔的规律性。

1 实验材料和方法

纳米孔的加工是采用FIB在氮化硅薄膜上穿孔的方法[2]。纳米孔的SEM图像和纯缓冲液下的离子电流如图1（a）和图1（b）所示。试验中使用食人鱼进行纳米孔的清洗，使用等离子清洗机进行亲水处理。

图1 纳米孔性能表征

磁珠基体为聚苯乙烯，外部修饰链霉亲和素。实验所用的DNA为λDNA，引物序列为P-5-GGGCGGCGACCTT-3-B，通过PCR扩增技术将引物修饰到DNA上，采用苯酚氯仿法提纯DNA。离心后，留底部沉淀磁珠，重复三遍，去掉原磁珠脱落的链霉亲和素及其他修饰物。加入DNA，将两者混合，轻摇振动，静置30 min，使绑定反应发生。

实验原理图如图2所示，采用左右液池，离子电极采用Ag/AgCl电极，连接两个电极浸在缓冲液中，CIS和TRANS液池之间唯一的联系就是纳米孔。缓冲液用的是1.0 mol/L的KCl溶液，调节pH值为8。离子电流的采集使用Axon公司的膜片钳放大器，其他装置全部放在法拉第笼中。

图2 工作原理图

2 实验结果与分析

在充分的混合、静置下，DNA与链霉亲和素结合，在电压驱动下，DNA能够穿过纳米孔，而磁珠无法穿过。开始阶段，DNA与磁珠通过布朗运动随机运动，当进入电场捕获区域时，DNA加速向纳米孔运动，使得过孔事件发生。DNA与磁珠具有不同的运动趋势，所以会导致绑定的DNA断裂，成为游离态的DNA通过纳米孔。每个过孔事件均具有相同的四个阶段：（1）进入阶段，电流急剧下降，DNA已经进入纳米孔；（2）弹性阶段，由于磁珠相对于DNA来说，其速度远远小于DNA的运动速度，所以在DNA进入纳米孔之后，与磁珠之间必定产生断裂，链霉亲和素-生物素之间的链接可以等效成弹性链接，在等效“弹簧”到达断裂临界点之前会有一个伸长过程，这个过程将导致DNA在纳米孔中的停留时间增加，时间分辨率提高；（3）在到达弹性临界点之后，随即进入断裂阶段；（4）DNA通过纳米孔，最后电流开始恢复。

图3所示为不同电压下过孔事件的个数。

图3 不同电压下过孔事件个数

实验表明，随着电压的增大（100～700 mV），其他条件相同的情况下（缓冲液浓度均为1.0 mol/L，pH=8.0，温度为室温），过孔事件发生次数随着电压的增加而增加，呈现一定的线性趋势，说明随着电压的增加，DNA通过纳米孔的捕获效率增加。该实验现象可以用公式（1）[3]进行解释：

式中，r*为电压捕获区域半径（与纳米孔的距离）；d为纳米孔直径；μ为DNA电泳迁移率；l为纳米孔长度；D为DNA的扩散系数；ΔV为偏置电压。

进而推出捕获率与偏置电压之间的关系，如公式（2）所示[3]：

由此可以看出，DNA的捕获率与偏置电压呈现线性关系。而磁珠绑定的DNA与之类似，当绑定着许多DNA的磁珠通过布朗运动进入捕获区域时，DNA在电场的驱动下开始向纳米孔运动，并最终通过纳米孔。

3 结语

本文研究了DNA与链霉亲和素修饰的磁珠绑定的情况，结果表明，DNA与磁珠实现了绑定，且随着电压的增大，磁珠绑定的DNA的捕获率增大。

[1]KASIANOWICZ J J，BRANDIN E，BRANTON D.Characterization of individual polynucleotide molecules using a membrane channel [J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1996(24):13770-13773.

[2]马建，王欣，李堃，等.基于氮化硅薄膜纳米孔制备及DNA分子检测[J].东南大学学报（自然科学版），2017，47（2）：265-270.

[3]WANUNU M，MORRISON W，RABIN Y，et al.Electrostatic focusing of unlabelled DNA into nanoscale pores using a salt gradient[J].Nature Nanotechnology，2010，5(2)：160-165.