采后柑橘果实糖酸代谢研究进展

梁芳菲,王小容,邓丽莉,曾凯芳,姚世响*

1(西南大学 食品科学学院，重庆，400715) 2(西南大学 国家级食品科学与工程实验教学示范中心，重庆，400715)

柑橘果实富含多种营养物质，如碳水化合物、维生素、抗氧化剂和矿质元素，深受消费者喜爱[1]。其中，糖酸是果实的核心食用品质，果实风味不仅取决于糖酸的含量，也取决于糖酸的种类和比例[2]。我国的柑橘品种主要在10月到12月之间成熟，采后贮藏是缓解集中上市造成的销售困难以及保障柑橘周年供应的主要策略。糖酸风味变淡是柑橘采后贮藏的主要问题之一，严重制约果品的食用价值和商品价值，影响柑橘产业的可持续发展[3]。因此，采后柑橘糖酸代谢是近年来采后生物学领域的研究重点和热点。本文综述了采后柑橘果实中糖酸的组成、变化规律及其代谢途径的最新研究进展，对推动采后柑橘果实糖酸代谢研究具有重要意义。

1 柑橘果实糖酸组成及在采后的变化规律

1.1 果实可溶性糖组分与含量及其在采后的变化规律

柑橘果实缺乏储备型碳水化合物，而是以积累可溶性糖为主，果实成熟时糖含量为10%左右[4]。可溶性糖主要有蔗糖、葡萄糖和果糖3种，这3种组分的比例在不同柑橘种类中不同[5]。在宽皮柑橘中，椪柑果实成熟时，蔗糖、葡萄糖和果糖含量分别为39、16、9 mg/g，比例约为4.3∶1.8∶1[6]，温州蜜柑成熟果实中蔗糖、葡萄糖和果糖含量比例约为5∶1∶1[7]。甜橙成熟时蔗糖、葡萄糖和果糖的比例约为1∶1∶1[8]，HB柚果实中也有类似的规律[9]。葡萄柚果实中，葡萄糖和果糖的含量相当，而蔗糖含量为葡萄糖的2～3倍[10]。

柑橘果实的可溶性糖主要来源于叶片的光合作用产物，果实采收之后失去母体的营养供给，仍是独立的“生命个体”，需维持正常的呼吸作用，为各种生理生化反应提供能量。可溶性糖含量在果实采后初期轻微增加后呈总体下降趋势[11]。宽皮柑橘中，温州蜜柑在10℃贮藏时果肉葡萄糖和果糖含量呈先升高后降低的趋势，贮藏90 d后葡萄糖和果糖含量分别下降了30.34%和18.83%[12]；椪柑果实在贮藏3个月后，可溶性糖含量下降了约30%[13]。“鲍威尔”脐橙在贮藏过程中蔗糖含量持续降低，葡萄糖和果糖含量则呈上升趋势[14]。HB(Hirado Buntan)柚果实在贮藏4月后，可溶性糖含量从76 mg/g下降至49 mg/g，蔗糖、葡萄糖和果糖呈相似的下降趋势[9]。

1.2 果实有机酸组分与含量及其在采后的变化规律

有机酸对柑橘果实的风味十分重要，含量过高或过低都会影响果实的正常风味。不同种类柑橘果实的有机酸含量差异较大，可分为低酸型(<0.8%)、中等酸型(0.8%～1.5%)、高酸型(>1.5%)[15]。柑橘有机酸主要有为柠檬酸、苹果酸、乌头酸、琥珀酸、延胡索酸等，其中柠檬酸占总有机酸含量的70%～90%，尤其在高酸和鲜食品种含量较高[15]。柠檬酸在果实生长发育过程中，由可溶性糖经三羧酸循环在线粒体合成后储于液泡[16]。

与可溶性糖相比，柑橘果实有机酸在采后的下降趋势更为剧烈。椪柑果实中柠檬酸占有机酸含量约90%，在采后3个月贮藏期内，下降约50%[13]。温州蜜柑果实在不同温度(5、10、20、30 ℃)贮藏14 d，有机酸含量呈显著下降趋势[17]。对柚类果实(HB柚、沙田柚和琯溪蜜柚)采后贮藏过程中的有机酸含量进行分析后发现：琯溪蜜柚柠檬酸含量呈上升趋势，苹果酸、乌头酸和延胡索酸在采后呈下降趋势；HB柚和沙田柚中4种有机酸含量呈整体下降趋势[18]。采后枯水时，柑橘有机酸迅速消耗，柠檬酸含量在椪柑、脐橙和琯溪蜜柚分别下降为对照的39%、20%和50%[19-21]。

对于部分有机酸含量较高的柑橘品种，需要在采后对其进行降酸处理，以提高品质。热处理是比较有效的方法，40 ℃热空气处理椪柑2 d后，在40 d的贮藏周期内，柠檬酸和总有机酸含量显著低于对照果实[22]。

1.3 果实中糖酸分布规律

柑橘果实中糖酸含量的分布特征在学术界并没有引起足够的重视。研究发现伏令夏橙果实中可溶性固形物呈极性分布的特征，即浓度从果蒂处向果顶处逐渐升高[23-24]。本课题组研究发现椪柑果实中的可溶性固形物和有机酸含量具有类似的极性分布特征[19]。考虑到柑橘的一些采后生物学现象具有位置效应，如柑橘枯水常发端于果蒂处并向果顶处发展[19]、血橙从果实顶部开始合成花青素并逐渐向果蒂处延展等，果实中糖酸的极性分布可能具有重要的生物学意义。

2 采后柑橘果实糖代谢途径

2.1 糖降解

柑橘果实糖代谢包括蔗糖合成代谢、蔗糖分解代谢和单糖降解代谢。蔗糖合成有2个重要步骤，蔗糖磷酸合酶(Sucrose phosphate synthase, SPS)催化尿苷二磷酸葡萄糖和6-磷酸果糖合成6-磷酸蔗糖，6-磷酸蔗糖由蔗糖磷酸酯酶(Sucrose phosphate phosphatase, SPP)水解生成蔗糖。采后柑橘果实的蔗糖代谢，其合成途径受抑制而降解途径被激活。催化蔗糖合成与降解的一个关键酶是蔗糖合酶(Sucrose synthase, SUS)，当尿苷二磷酸(Uridine diphosphate，UDP)存在时，蔗糖合酶可逆地催化蔗糖裂解为UDP-葡萄糖和果糖。转化酶(Invertase, IN)是催化蔗糖降解的关键酶，根据亚细胞定位分为细胞壁转化酶(Cell wall invertase, CWIN)、细胞质转化酶(Cytoplasmic invertase, CIN)和液泡转化酶(Vacuolar invertase, VIN)。转化酶不可逆地催化蔗糖降解成葡萄糖和果糖，其中从质外体途径进入的蔗糖被CWIN水解，从胞间连丝进入的蔗糖被CIN水解，储存在液泡中的蔗糖被VIN水解[25]。

温州蜜柑果实的SUS酶活性在发育早期较高，随后下降，在成熟时期又急剧升高，SUS酶活与蔗糖积累有很强相关性，这表明SUS在柑橘果实蔗糖的合成代谢中起重要作用[26]。生物信息学分析和基因表达实验的结果显示柑橘基因组至少存在6个编码SUS的基因[27]。在采后贮藏过程中，柑橘SUS的表达模式比较复杂，蛋白质组学揭示椪柑果实SUS的蛋白水平没有显著变化[13]，而在“鲍威尔”脐橙中，SUS的基因转录水平呈部分上升和部分下降的特征[14]，这暗示SUS可能不是柑橘果实采后蔗糖含量变化相关的主要酶。对椪柑果实采后枯水的研究发现，SUS的转录水平显著下降，显示SUS可能在柑橘枯水时蔗糖快速消耗过程中发挥重要作用[19]。椪柑果实在采后低温贮藏过程中，有2个转化酶编码基因(Cit.29849.1.S1_at and Cit.29601.1.S1_s_at)表达量上调，其可能参与催化蔗糖降解为葡萄糖和果糖[28]。脐橙采后贮藏时CWIN和CIN基因普遍呈上调表达的特征，表明转化酶在蔗糖降解为单糖过程中起重要作用[14]。椪柑采后枯水时转化酶基因表达量显著上调，可能与与蔗糖消耗密切相关[19]。

单糖降解途径有果糖激酶(Fructokinase, FRK)和己糖激酶(Hexokinase, HXK)2个关键酶，分别催化果糖和葡萄糖生成6-磷酸果糖和6-磷酸葡萄糖，然后进入糖酵解途径和三羧酸循环，为细胞的生理生化反应提供能量。脐橙采后贮藏过程中，包括FRK、HXK和磷酸葡萄糖变位酶(Phosphoglucomutase，pgm)的基因表达普遍呈上调趋势；另外糖酵解途径相关酶，如6-磷酸果糖激酶(6-Phosphofructokinase 3，PFK3)、果糖-1,6-二磷酸醛缩酶(Fructose-bisphosphate aldolase，FBA)、烯醇化酶和丙酮酸激酶(Pyruvate kinase，PK)等的编码基因均呈现表达量上调趋势；这些结果表明蔗糖降解为葡萄糖和果糖，然后进入糖酵解途径被消耗是柑橘采后可溶性糖含量降低的重要机制[14]。运用转录组学和代谢组学技术对采后贮藏阶段的椪柑、甜橙、柠檬和柚子进行系统研究后发现，大量糖降解途径相关基因的表达量呈上调趋势[11]。椪柑在采后枯水时，HXK基因表达量显著上调[19]。

另外，糖降解途径的中间产物还可作为细胞壁组分的合成前体。蔗糖的降解产物UDP-葡萄糖经UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-glucose pyrophosphorylase，UGP)催化后进入纤维素合成途径[29]。UDP-葡萄糖在生成UDP-葡萄糖醛酸后，由UDP-葡萄糖醛酸-差向异构酶(UDP-glucuronate 4-epimerase，GAE)和半乳糖醛酸转移酶(Galacturonosyltransferase，GAUT)催化进入果胶合成途径[30]。椪柑在采后枯水时，汁胞UGP、GAE和GAU6T基因的表达量均显著上升，表明枯水时可溶性糖流向了细胞壁合成途径[19]。另外糖酵解的产物也可进入细胞壁合成途径，如磷酸烯醇式丙酮酸可通过莽草酸途径合成苯丙氨酸，然后进入木质素合成途径。椪柑枯水时，木质素合成途径的关键酶-肉桂醇脱氢酶(Cinnamyl alcohol dehydrogenase，CAD)基因表达量显著上调[19]。

2.2 糖转运

可溶性糖在不同细胞器、不同汁胞、不同组织(果肉和果皮)之间的转运由蔗糖转运子(Sucrose transporter, SUT)、单糖转运子(Monosaccharide transporter, MST)、SWEET(Sugar will eventually be exported transporter)等蛋白家族完成[25, 31]。蔗糖转运子是一类具有蔗糖转运活性的蔗糖载体，广泛存在于高等植物细胞和组织中介导蔗糖的跨膜运输，生物信息学分析显示柑橘基因组中有3个SUT基因[32]。SUT1基因在草莓中具有重要功能，沉默SUT1基因会降低果实蔗糖含量并延迟成熟[33]；“奉节72-1”和晚熟突变体“奉晚”脐橙成熟时SUT1基因表达均发生显著变化，显示SUT1基因可能在柑橘果实成熟时扮演重要功能[2]。苹果中的最新研究发现，ABA响应转录因子MdAREB2通过激活SUT基因提高果实中蔗糖的含量，这种ABA调控蔗糖积累的机制可能在果实中普遍存在[34]。

单糖转运子(MST)主要位于细胞膜和液泡膜上介导葡萄糖、果糖的运输。生物信息学分析显示甜橙基因组中有58个MST，可以分为7个亚家族[35]。甜橙MST基因启动子区域存在可能被糖、激素和胁迫作用的顺式作用元件，部分MST成员在果实成熟过程中表达量显著上调[35]。糖转运蛋白SWEET家族介导细胞内蔗糖的外排，对于蔗糖的韧皮部装载十分重要[36]。甜橙基因组有16个SWEET基因家族成员，其中部分成员在果实成熟过程特异性地表达[35]。

部分柑橘种类在采后贮藏过程中，果皮有相对再生长的现象，因此需要从果肉转运包括糖在内的营养物质至果皮[37-38]。程运江课题组运用转录组学和代谢组学技术对柑橘果实采后贮藏中糖酸组分变化及相关基因表达进行了系统研究，结果发现，柑橘在采后贮藏过程中，尤其是包括椪柑在内的宽皮柑橘，存在极为显著的营养物质从果肉到果皮的转运，从而维持果皮对逆境胁迫的适应能力[11]。

3 采后柑橘果实有机酸代谢

柑橘果实有机酸合成于果实生长发育阶段，在成熟后期开始逐渐降解。柠檬酸在线粒体由柠檬酸合成酶(Citrate synthase，CS)催化草酰乙酸和乙酰辅酶A生成。柠檬酸降主要有以下几种途径：作为底物参与三羧酸循环为细胞供能；γ-氨基丁酸(Gamma-aminobutyric acid, GABA)支路；合成谷氨酰胺以及其他氨基酸；合成次生代谢物以及芳香物质、植物激素和黄酮等[15, 22]。

3.1 三羧酸循环

柠檬酸作为三羧酸循环的底物，直接参与呼吸作用，为细胞的各种生理生化途径提供能量，这是柑橘采后柠檬酸降解的重要途径[4]。在三羧酸循环中，线粒体顺乌头酸酶(Aconitase, Aco)将柠檬酸异构化为异柠檬酸，然后由NAD型异柠檬酸脱氢酶(NAD-isocitrate dehydrogenase, NAD-IDH)催化脱氢生成α-酮戊二酸。分析柠檬果实成熟过程中Aco酶活性后发现线粒体Aco酶活的降低有利于成熟阶段柠檬酸的积累，而细胞质Aco酶活的升高则有助于成熟后期柠檬酸含量的降低[39]。对多种柑橘果实(椪柑、甜橙、柠檬、柚类)采后衰老过程中的基因表达进行转录组学分析，结果表明三羧酸循环相关基因呈上调趋势，这表明包括三羧酸在内的呼吸途径是柑橘采后柠檬酸含量降低的重要原因[11]。对HB柚(Citrusgrandis)和Fairchild (Citrusreticulata)的40个杂交群体进行分析后，发现采后柠檬酸含量高的群体是由于线粒体Aco酶的活性较低，进而三羧酸循环活性被抑制所致[40]。琯溪蜜柚粒化汁胞中Aco活性显著高于正常汁胞，并且基因表达也显著升高，这是柠檬酸快速消耗的重要原因[21]。椪柑采后贮藏过程中，Aco和IDH基因在枯水汁胞中的表达量显著低于正常汁胞，表明三羧酸循环在采后枯水时被激活，参与有机酸的消耗[19]。另外，血橙采前套袋处理可降低果实柠檬酸含量，提升果实品质，转录组结果显示这可能与三羧酸循环活性升高，促进酸消耗有关[41]。

3.2 GABA支路与谷氨酰胺合成途径

细胞质Aco将柠檬酸催化为异柠檬酸，再由NADP型异柠檬酸脱氢酶(NADP-isocitrate dehydrogenase, NADP-IDH)催化生成α-酮戊二酸。α-酮戊二酸有两个去处：经谷氨酸脱羧酶催化生成GABA，进入GABA支路，或经谷氨酸脱氢酶(Glutamate dehydrogenase, GDH)生成谷氨酸后由谷氨酰胺合酶(Glutamine synthase, GS)催化生成谷氨酰胺。GABA可转运至线粒体，在GABA转氨酶和琥珀酸半醛脱氢酶催化生成琥珀酸，重新进入三羧酸循环[42]。GABA支路与谷氨酰胺合成途径是柑橘果实柠檬酸降解的重要途径。对柑橘汁胞和愈伤组织进行缺铁处理，显著抑制了细胞质顺乌头酸酶活性，并伴随着柠檬酸在柑橘果实中的大量积累[43]。CHEN等[22]从椪柑中克隆了3个Aco编码基因，发现CitAco3在柠檬酸降解过程中起主要作用，在柑橘果实中过表达可显著降低柠檬酸含量[44]。

LIU等从柑橘中克隆了2个编码谷氨酸脱羧酶(Glutamate decarboxylase, GAD)的基因CsGAD1和CsGAD2，在果实成熟过程中CsGAD1表达量是CsGAD2的2倍，并且CsGAD1表达量与谷氨酸脱羧酶活性呈正相关，与有机酸含量呈负相关；这表明柑橘CsGAD1基因在果实柠檬酸降解合成GABA途径中起关键作用[45]。HB柚在长期贮藏中，GABA和谷氨酰胺含量均显著上升，这暗示这些物质的合成可能是有机酸降解的去处[9, 18]。对HB柚(Citrusgrandis)和Fairchild(Citrusreticulata)的杂交群体分析发现，GABA支路的低活性导致柑橘果实中柠檬酸的高含量[40]。用GABA处理采后柑橘果实，可以显著缓解柠檬酸含量的降低，保持果实品质，这进一步证明GABA支路是柑橘采后柠檬酸降解的重要流向[46]。对刚采收的椪柑用热处理(40 ℃热空气，2 d)可有效降低果实柠檬酸含量，提高风味；在此过程中，细胞质Aco、IDH和GAD基因表达量均显著升高，而糖酵解相关基因表达量并无显著变化，表明GABA支路是热处理降低果实柠檬酸的可能机制[22]。另外，椪柑采后贮藏过程中，枯水汁胞中的GABA支路与谷氨酰胺合成途径的相关基因均被激活，暗示其参与了枯水汁胞中柠檬酸含量的降低[19]。尽管不同生境对柑橘果实的可溶性糖影响很小，但是对有机酸含量有显著影响。对不同生境的脐橙(“纽荷尔”脐橙和“朋娜”脐橙)进行研究后，发现生境导致有机酸含量差异的机制可能与柠檬酸合成谷氨酰胺的活性，即柠檬酸在细胞质中通过Aco-IDH-GDH-GS相继催化最终合成谷氨酰胺的活性有关[47]。

3.3 乙酰辅酶A合成途径

在细胞质中，ATP-柠檬酸裂解酶(ATP citrate lyase，ACL)可催化柠檬酸生成草酰乙酸和乙酰辅酶A。乙酰辅酶A参与合成异戊二烯和黄酮等次生代谢物。血橙在低温(8 ℃)贮藏2～3个月时有机酸含量降低，同时花青素含量增加了约9倍[48]。另外低温(6 ℃)贮藏2个月可显著增加血橙中花青素、黄烷酮的含量[49]。血橙在采后低温贮藏过程中，柠檬酸含量逐渐降低，ATP-柠檬酸裂解酶活性增强，柠檬酸降解的部分产物合成花青素，从而黄酮含量逐渐升高[50]。“鲍威尔”脐橙在采后衰老过程中，果实的ATP-柠檬酸裂解酶基因表达增强，异戊二烯和黄酮合成相关基因的表达有一定程度的上调表达[14]。椪柑枯水汁胞中，ATP-柠檬酸裂解酶基因表达也显著增强[19]。

3.4 柠檬酸降解途径相关转录因子

转录因子是调控基因转录的关键分子，对柠檬酸降解途径转录因子的研究将有助于理解柠檬酸降解的分子机制，为调控柑橘柠檬酸代谢提供理论借鉴。LI等[51]从椪柑克隆了一个R2R3 MYB家族的转录因子CrMYB73，基因表达与果实柠檬酸积累呈正相关，在烟草中过表达该基因可以诱导柠檬酸的积累。这表明CrMYB73可能是一个调控柠檬酸合成的转录因子[51]。Aco是柠檬酸降解途径的关键酶，其中CitAco3是关键基因，LI等发现转录因子CitNAC62和CitWRKY1协同作用，共同激活CitAco3的转录[52]。液泡型H+转运ATP酶(V-ATPase)在有机酸转运至液泡积累的过程中起重要作用[15]。LI等筛选了5个可能对柠檬酸积累起重要作用的V-ATPase基因，酵母双杂交和双分子荧光互补结果表明CitVHA-c4与转录组因子CitERF13可以相互作用。在拟南芥中同时过表达CitVHA-c4与CitERF13能够提高柠檬酸含量，但在VHA突变体中过表达CitERF13则不能提高柠檬酸含量，这意味着CitERF13调控柠檬酸含量必须依赖于VHA[44]。

4 展望

糖酸是柑橘果实的核心食用品质，一直是学术界研究的重点和热点。现有研究揭示了柑橘果实糖酸组分及含量在采后的变化规律、采后可溶性糖的降解机制、采后柠檬酸降解的主要途径等。笔者认为采后柑橘糖酸代谢的研究还存在以下不足，可作为未来的研究重点：(1)尽管柑橘采后贮藏过程中的糖酸代谢途径较为清楚，但对于柑橘采后枯水时糖酸迅速耗竭的分子机制还不清楚；(2)目前已知的柑橘采后有机酸降解途径的关键转录因子还比较少；(3)协同调控糖酸降解与其他代谢物合成的分子机制是什么，参与调控该过程的转录因子有哪些？