分心木中化学成分的分离与鉴定

王 丹,董红敬,杨 鹏,王 晓,耿岩玲,*

(1.山东农业大学食品科学与工程学院,山东泰安 271018;2.齐鲁工业大学(山东省科学院),山东省分析测试中心,山东省中药质量控制技术重点实验室,山东济南 250014;3.济南森康三峰生物工程有限公司,山东济南 250014)

分心木(DiaphragmajuglandisFructus)为胡桃科植物胡桃(JuglansregiaL.)果核内的干燥木质隔膜,是新疆维吾尔族传统药物之一,其特点为味苦、涩,性平,入脾、肾二经。分心木的功效在《本草再新》、《全国中草药汇编》中均有记载,常用于肾虚[1]、遗精滑泻、尿频遗尿、慢性肾功能不全和慢性肾炎[2]等疾病的治疗;将分心木与其他药物配伍,还可以治疗失眠多梦、牙龈出血、口腔溃疡、多汗[3]等。分心木中主要含有挥发油类、酚酸类、黄酮类、蒽醌类、皂苷类等化合物[4-5]。

近年来,有关分心木化学成分系统研究的报道较少,分离鉴定物质成分不全面。药理活性研究表明:分心木乙醇、正丁醇和水提取物均可不同程度的改善肾阳虚小鼠模型的状况[6],分心木甲醇、乙醇和石油醚提取液均具有较好的抗菌效能[7],分心木中总皂苷和总黄酮均具有较强的抗氧化活性[8],分心木乙酸乙酯和正丁醇提取物均具有较强的抗肿瘤作用[9]。这些研究主要针对分心木的提取物,药效物质基础大多不明确,单体成分有待于进一步研究与开发。此外,在核桃的生产加工中,核桃仁因具有极高的营养价值,产生了大量的分心木;但是目前关于分心木的利用研究较少,造成了资源的大量浪费。因此,为增加核桃副产物的附加值,使资源可持续利用,有必要对分心木化学成分进行系统研究。

本课题组前期已经对分心木的乙酸乙酯部位化学成分进行了系统研究和报道[10],本研究在前期工作基础上利用现代色谱技术和分离纯化方法对分心木的石油醚部位和水部位化学成分进一步深入系统研究,并通过先进的波谱技术对化合物的化学结构进行鉴定解析,为进一步开发利用核桃属植物资源,深入了解其药用活性成分奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

分心木 采自安徽亳州药材市场,经鉴定为胡桃科植物胡桃(JuglansregiaL.)果核内的木质隔膜;甲醇 色谱纯,海洋石油化工有限公司;水(HPLC) 娃哈哈饮用水有限公司;95%乙醇 淄博丹阳化工有限公司;石油醚、乙酸乙酯 分析纯,济南禹安化工有限公司;甲酸 色谱纯,天津市科密欧化学试剂有限公司。

Waters 2695型高效液相色谱仪 配有YMC-PEAK ODS-A分析型色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)Waters公司;普源L-3000高效液相色谱仪 配有YMC-PEAK ODS-A半制备型色谱柱(250 mm×10.0 mm,5 μm),北京普源精电科技有限公司;Agilent 1200 RRLC-6410 QQQ-MS/MS质谱仪 Agilent公司;INOVA-400型核磁共振波谱仪 Varian公司;R-3型旋转蒸发器 瑞士Buchi公司;柱色谱硅胶(200～300 目) 青岛鼎康硅胶有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 粗提物的制备 参考文献[5,11]的提取方法,取分心木9 kg,粉碎,过80目筛,用95%乙醇水溶液80 ℃加热回流提取2次,每次2 h,料液比1∶4 (w/v),合并提取液并减压浓缩得乙醇提取物;加水混悬后依次用等体积的石油醚、乙酸乙酯萃取6次,合并每部分萃取液,分别通过旋转蒸发仪在真空度60 hPa、水浴温度55 ℃的条件下减压浓缩干燥至浸膏状,得石油醚部位(195.68 g)、乙酸乙酯部位(47.27 g)和水部位(98.21 g),其含水率分别为石油醚部位0.7%、乙酸乙酯部位4.5%和水部位6.5%。

1.2.2 分离纯化

1.2.2.1 石油醚部位 取石油醚部位浸膏40 g,经硅胶柱色谱分离,依次用石油醚-乙酸乙酯(10∶0,8∶2,5∶5,2∶8,0∶10)进行梯度洗脱,共得到20个馏分(FS.1～FS.20)。其中FS.7和FS.10分别通过半制备高效液相色谱进行分离,采用甲醇-水(60∶40,V/V)等度洗脱,得到化合物1(10.2 mg)和化合物2(10.4 mg);FS.12通过半制备高效液相色谱进行分离,采用甲醇-水(50∶50,V/V)等度洗脱,得到化合物3(3.3 mg)和化合物4(1.9 mg)。

1.2.2.2 水部位 取水部位浸膏98 g,经MCI柱色谱分离,依次用甲醇-水(5%、30%、60%、80%、100%)进行梯度洗脱,共得到12个馏分(Fr.1～Fr.12)。其中Fr.3(3.33 g)和Fr.4(5.47 g)分别通过反相C18中压柱色谱进行分离,分别依次用甲醇-水(5%、10%、20%、30%、40%)进行梯度洗脱。Fr.3的5%甲醇洗脱部位(0.26 g)通过半制备高效液相色谱进行分离,采用甲醇-水(18∶82,V/V)等度洗脱,得到化合物5(11.50 mg);Fr.3的30%甲醇洗脱部位(0.15 g)通过半制备高效液相色谱进行分离,采用甲醇-水(35∶65,V/V)等度洗脱得到化合物6(4.5 mg)和化合物7(14.80 mg)。Fr.4的5%甲醇部位(0.10 g)通过半制备高效液相色谱进行分离,采用甲醇-水(10∶90,V/V)等度洗脱,得到化合物8(36.80 mg);Fr.4的20% 甲醇洗脱部位(0.34 g)通过半制备高效液相色谱进行分离,采用甲醇-水(15∶85,V/V)等度洗脱,得到化合物9(11.4 mg)。

1.2.3 结构鉴定 采用质谱仪和核磁共振波谱仪对化合物的结构进行鉴定。质谱条件:离子源:电喷雾离子化源(ESI);模式:正、负离子模式;扫描范围:m/z为100～1000;喷雾气压:30 psi;干燥气流速:10.0 L/min;干燥气温度:350 ℃。核磁条件:根据Varian INOVA-400型核磁共振波谱仪和Varian INOVA-600型核磁共振波谱仪的相应参数设置,以TMS为内标。

1.3 数据处理

质谱数据通过Agilent Mass Hunter Qualitative Analysis软件处理,获得各化合物的分子量信息。核磁共振波谱数据通过MestReNova软件处理,获得相应的1H-NMR和13C-NMR信息。

2 结果与分析

化合物1:ESI-MS:m/z219[M+H]+;1H-NMR(CD3OD,400 MHz)δ:7.64(1H,d,J=7.6 Hz,H-8),7.60(1H,d,J=2.0 Hz,H-7),7.26(1H,dd,J=7.6,1.8 Hz,H-6),6.20(1H,s,H-3),4.13(2H,q,J=7.0 Hz,H-1′),1.48(3H,t,J=7.2 Hz,H-2′);13C-NMR(CD3OD,100 MHz)δ:191.1(C-4),179.5(C-1),160.7(C-5),160.5(C-2),135.2(C-7),131.3(C-9),124.3(C-6),118.7(C-8),114.0(C-10),109.4(C-3),65.5(C-1′),12.8(C-2′)。该化合物氢谱、碳谱数据与文献[12]报道的2-乙氧基胡桃醌数据基本一致,故鉴定化合物1为2-乙氧基胡桃醌。

化合物2:ESI-MS:m/z357[M+H]+,355[M-H]-;1H-NMR(CD3OD,400 MHz)δ:6.89(1H,d,J=6.4 Hz,H-5),6.87(1H,d,J=6.4 Hz,H-18),6.65(1H,dd,J=8.2,2.0 Hz,H-19),6.43(1H,d,J=8.0 Hz,H-6),5.55(1H,d,J=2.0 Hz,H-15),2.64(1H,m,H-13a),2.95(1H,m,H-13b),2.31(2H,m,H-12),2.21(2H,m,H-10),1.52(2H,m,H-9),1.81(1H,m,H-8a),1.66(1H,m,H-8b),3.17(1H,m,H-7a),2.36(1H,m,H-7b),3.89(3H,s,2-OCH3),3.81(3H,s,17-OCH3)。13C-NMR(CD3OD,100 MHz)δ:211.6(C-11),149.6(C-16),149.4(C-3),146.6(C-1),146.5(C-17),140.7(C-2),134.3(C-14),125.9(C-5),125.7(C-4),121.4(C-19),114.5(C-6),112.9(C-15),112.4(C-18),45.8(C-10),40.6(C-12),29.8(C-7),26.6(C-13),24.0(C-8),18.8(C-9),60.3(2-OCH3),55.5(17-OCH3)。该化合物氢谱、碳谱数据与文献[13-15]报道的胡桃苷A数据基本一致,故鉴定化合物2为胡桃苷A。

化合物3:ESI-MS:m/z179[M+H]+,201[M+Na]+,分子式为C10H10O3;1H-NMR(CDCl3,600 MHz)δ:12.43(1H,s,OH-8),7.52(1H,dd,J=8.4 Hz,7.8 Hz,H-6),7.04(1H,d,J=7.8 Hz,H-5),6.95(1H,d,J=8.4 Hz,H-7),4.94(1H,dd,J=7.8,3.6 Hz,H-4),3.02(1H,m,H-2b),2.67(1H,m,H-2a),2.37(1H,m,H-3b),2.21(1H,m,H-3a);13C-NMR(CDCl3,150 MHz)δ:204.3(C-1),34.6(C-2),31.2(C-3),67.7(C-4),145.9(C-4a),117.8(C-5),137.0(C-6),117.4(C-7),162.8(C-8),115.3(C-8a)。该化合物氢谱、碳谱数据与文献[11,16]报道的4,8-二羟基-1-四氢萘醌数据基本一致,故鉴定化合物3为4,8-二羟基-1-四氢萘醌。

化合物4:ESI-MS:m/z209.1[M+H]+,231.1[M+Na]+,417.2[2M-H]+,439.2[2M+Na]+;1H-NMR(CDCl3,600 MHz)δ:5.87(1H,s,H-4),2.57(1H,m,H-8a),2.54(1H,m,H-8b),2.39(1H,d,J=17.4 Hz,H-2a),2.18(3H,s,10-CH3),2.07(1H,d,J=17.4 Hz,H-2b),2.03(3H,m,13-CH3),2.00(1H,m,H-7a),1.91(1H,t,J=5.6 Hz,H-6),1.73(1H,m,H-7b),1.08(3H,s,12-CH3),1.04(3H,s,11-CH3)。13C-NMR(CDCl3,150 MHz)δ:207.6(C-9),199.1(C-3),164.7(C-5),125.6(CH,C-4),50.1(CH,C-6),47.0(CH2,C-2),42.5(C-1),36.3(CH2,C-8),30.1(CH3,C-10),28.8(CH3,C-11),27.3(CH3,C-12),24.6(CH2,C-7),23.5(CH3,C-13)。该化合物氢谱、碳谱数据与文献[17]报道的4-megastigmen-3,9-dione数据基本一致,故鉴定化合物4为4-megastigmen-3,9-dione。

化合物5:ESI-MS:m/z339[M+H]+,361[M+Na]+,399[2M+Na]+;1H-NMR(DMSO-d6,400 Hz)δ:9.99(-OH),7.54(2H,d,J=8.4 Hz,H-2,6),7.51(1H,d,J=15.8 Hz,H-α),6.80(2H,d,J=8.4 Hz,H-3,5),6.33(1H,d,J=15.8 Hz,H-β),5.18(1H,dt,H-3′),4.89(1H,s,C4′-OH),4.88(1H,s,C1′-OH),3.86(1H,m,H-5′),3.55(1H,d,J=3.2 Hz,H-4′),1.92(3H,m,H-2′a,e,6′e),1.74(1H,m,H-6′a)。13C-NMR(DMSO-d6,100 Hz)δ:176.54(-COOH),166.61(C=O),160.09(C-4),144.48(C-α),130.53(C-2,6),125.76(C-1),116.26(C-3,5),115.73(C-β),73.37(C-1′),71.64(C-5′),71.44(C-3′),67.81(C-4′),38.71(C-6′),35.58(C-2′)。该化合物氢谱、碳谱数据与文献[18]报道的3′-O-(E-4-coumaroyl)-quinic acid数据基本一致,故鉴定化合物5为3′-O-(E-4-coumaroyl)-quinic acid。

化合物6:ESI-MS:m/z281[M-H]-,分子式为C15H22O5;1H-NMR(CD3OD,400 MHz)δ:7.88(1H,d,J=15.2 Hz,H-4),6.39(1H,d,J=15.2 Hz,H-5),5.68(3H,s,H-2),3.90(1H,m,H-9),3.63(1H,d,J=7.2 Hz,H-12a),3.55(1H,d,J=7.2 Hz,H-12b),1.86(1H,dd,J=13.6,6.8 Hz,H-8a),1.70(1H,dd,J=13.6,6.8 Hz,H-8b),1.61(1H,dd,J=13.2,10.4 Hz,H-10a),1.53(1H,dd,J=13.2,10.4 Hz,H-10b),1.99(3H,s,H-15),1.00(3H,s,H-14),0.80(3H,s,H-13)。13C-NMR(CD3OD,100 MHz)δ:167.9(C-1),119.6(C-2),148.7(C-3),130.1(C-4),134.9(C-5),81.9(C-6),86.2(C-7),45.9(C-8),64.3(C-9),44.4(C-10),48.5(C-11),75.8(C-12),16.6(C-13),20.0(C-14),21.2(C-15)。该化合物氢谱、碳谱数据与文献[19]报道的二氢红花菜豆酸数据基本一致,故鉴定化合物6为二氢红花菜豆酸。

化合物7:ESI-MS:m/z339[M+H]+;1H-NMR(DMSO-d6,400 Hz)δ:10.02(-OH),7.55(2H,d,J=8.4 Hz,H-2,6),7.52(1H,d,J=15.8 Hz,H-α),6.80(2H,d,J=8.4 Hz,H-3,5),6.35(1H,d,J=15.8 Hz,H-β),5.45(1H,s,C3′-OH),5.17(1H,dt,H-5′),4.94(1H,s,C4′-OH),4.80(1H,s,C1′-OH),3.80(1H,m,H-3′),3.62(1H,s,H-4′),1.99(3H,m,H-2′a,e,6′e),1.84(1H,m,H-6′a)。13C-NMR(DMSO-d6,100 Hz)δ:174.67(-COOH),166.51(-CO),160.19(C-4),144.62(C-7),130.58(C-2,6),125.69(C-1),116.26(C-3,5),115.55(C-8),73.15(C-1′),70.87(C-5′),70.35(C-3′),68.24(C-4′),38.71(C-6′),35.36(C-2′)。该化合物氢谱、碳谱数据与文献[18]报道的5′-O-(E-4-coumaroyl)-quinic acid数据基本一致,故鉴定化合物7为5′-O-(E-4-coumaroyl)-quinic acid。

化合物8:ESI-MS:m/z 353[M+Na]+,分子式为C14H18O9;1H-NMR(DMSO-d6,400 MHz)δ:7.51(1H,dd,J=8.4,2.0 Hz,H-6),7.48(1H,d,J=1.6 Hz,H-2),7.16(1H,d,J=8.4 Hz,H-5),5.04(1H,d,J=7.2Hz,H-1′),3.81(3H,s,-OCH3),3.45(2H,m,H-6′a,6′b),3.15-3.30(4H,m,H-2′,3′,4′,5′)。13C-NMR(DMSO-d6,100 MHz)δ:167.5(C-7),150.7(C-4),148.9(C-3),124.6(C-1),123.3(C-6),114.8(C-5),113.2(C-2),100.0(C-1′),77.5(C-5′),77.3(C-3′),73.6(C-2′),70.0(C-4′),61.1(C-6′),56.1(-OCH3)。该化合物氢谱、碳谱数据与文献[20-22]报道的香草酸4-O-β-D-葡萄糖苷数据基本一致,故鉴定化合物8为香草酸4-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物9:ESI-MS:m/z443.1[M-H]-,分子式为C21H32O10;1H-NMR(DMSO-d6,400 Hz)δ:7.89(1H,d,J=15.6 Hz,H-4),6.55(1H,d,J=15.6 Hz,H-5),5.77(1H,s,H-2),5.39(1H,d,J=8.0 Hz,H-1′),3.91(1H,m,H-9),3.64(2H,m,H-6′),3.89(2H,m,H-12),3.46(1H,d,J=5.6 Hz,H-5′),3.43(1H,d,J=5.6 Hz,H-3′),3.25(1H,d,J=8.8 Hz,H-2′),3.21(1H,d,J=7.6Hz,H-4′),3.14(1H,m,H-11),2.08(3H,s,H-15),1.87(1H,m,H-8),1.71(1H,m,H-10),1.62(1H,m,H-8),1.53(1H,m,H-10),1.01(3H,s,H-14),0.81(3H,s,H-13)。13C-NMR(DMSO-d6,100 Hz)δ:164.28(C-1),153.02(C-3),137.30(C-5),129.71(C-4),116.51(C-2),94.33(C-1′),86.24(C-7),82.01(C-6),78.34(C-3′),77.06(C-5′),75.83(C-12),72.87(C-2′),70.01(C-4′),64.32(C-9),61.07(C-6′),48.61(C-11),45.96(C-8),44.38(C-8),21.31(C-15),19.99(C-14),16.54(C-13)。该化合物氢谱、碳谱数据与文献[23]报道的litchiol A数据基本一致,故鉴定化合物9为litchiol A。

从石油醚部位浸膏分离出的物质(化合物1,2,3,4)多为醌类及其衍生物,极性较小;而乙酸乙酯萃取后的水部位浸膏分离出的物质(化合物5,6,7,8,9)多为羧酸类,极性较大,分离难度大。根据化合物的性质,对石油醚部位浸膏采用碱性硅胶柱色谱洗脱,乙酸乙酯萃取后的水部位浸膏采用MCI和反相C18中压半制备柱色谱相结合的方法进行分离,但所得化合物纯度都不高,需要进一步纯化。最终我们采用高效液相色谱制备的方法进行纯化,大大减少了醌类和羧酸类化合物的损失。

3 结论

分心木乙醇提取物的石油醚部位浸膏和水部位浸膏,经多种柱色谱分离纯化,根据高效液相色谱检测其纯度,得到了9个高纯度的化合物,应用质谱和核磁共振波谱阐明其化学结构,分别鉴别为2-乙氧基胡桃醌(1)、胡桃苷A(2)、4,8-二羟基-1-四氢萘醌(3)、4-megastigmen-3,9-dione(4)、3′-O-(E-4-coumaroyl)-quinic acid(5)、二氢红花菜豆酸(6)、5′-O-(E-4-coumaroyl)-quinic acid(7)、香草酸4-O-β-D-葡萄糖苷(8)和litchiol A(9),其中化合物4,5,7,8和9为首次从核桃种属植物中分离得到。分心木的石油醚部位和水部位存在多种醌类和羧酸类化合物,实验进一步丰富了分心木的化学成分,为下一步的药理活性研究奠定基础,对于深入了解该种药用植物的活性成分与药用价值具有重要意义。