生物酶解法去除大豆蛋白抗原性研究进展

王章存,袁路阳,张 露,胡金强,安广杰,王 佩

(1.郑州轻工业学院食品与生物工程学院,河南郑州 450001;2.食品生产与安全河南省协同创新中心,河南郑州 450001)

大豆蛋白是来源丰富的植物蛋白,其氨基酸组成与人体蛋白十分接近,具有很高的营养价值。大豆蛋白具有优良的溶解、乳化和发泡等加工性能,在食品生产中得到广泛应用。然而,大豆含有多种引起人体过敏的抗营养成分,被列为世界八大致敏食物之一[1-2],其主要成分是蛋白质,目前已从大豆中确认出38种抗原蛋白[3]。大豆蛋白主要引起人或动物发生IgE介导的Ⅰ型速发型过敏反应,还会导致人体和动物毛细血管渗透性增加、血浆蛋白漏入肠腔、肠黏膜水肿、细胞脱颗粒释放组胺、前列腺素等[4-5]。大豆过敏患者临床症状大多表现为过敏性皮炎,有些可能会出现严重失水甚至死亡[6-7]。人体一旦出现大豆过敏反应,目前尚无有效的治疗方法。因此,降低或者消除大豆蛋白的抗原性是食品安全中的重要课题,受到科技和产业界的广泛关注。

热处理是食品加工中最常用的方法,但加热并不能有效降低大豆蛋白的致敏性[8]。高压处理也未获得满意的效果[9-11]。酸、碱等化学处理往往使大豆蛋白大分子降解为小分子,其乳化、发泡等功能性质大大降低,而且酸法水解对设备要求较高,容易造成环境污染。生物酶解法可以通过不同酶制剂进行选择性酶解,被认为是降低甚至完全消除大豆蛋白抗原性的有效方法[12],而且合适的酶解条件还可保持甚至改善大豆蛋白的乳化、发泡等物化性质,赋予大豆蛋白新的加工性能[13-14]。因此,近年来生物酶解法改性降低大豆蛋白抗原性的研究受到人们的广泛关注。本文在介绍大豆抗原蛋白分子组成和结构特征的基础上,重点介绍生物酶解法降低大豆蛋白抗原性的研究进展,希望为今后降低大豆蛋白抗原性的相关研究提供一定的参考价值。

1 大豆抗原蛋白的基本成分

大豆中的蛋白种类较多,根据沉降系数可分为2S、7S、11S和15S等四类组分。根据生理功能可分为生理活性蛋白和储藏蛋白两大类,其中生理活性蛋白主要包括血球凝集素、胰蛋白酶抑制剂、β-淀粉酶等,它们的含量较低且对热敏感,一般的食品加热过程即可灭去其活性;大豆储藏蛋白包括大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白两大类,其含量分别约占总蛋白40%和30%[15]。通常所说的11S和7S球蛋白主要是指这两种蛋白质,它们是大豆中的主要抗原蛋白[16-18]。

大豆球蛋白(11S)是由六个亚基组成的六聚体寡蛋白,每个亚基由一个酸性多肽链(A链)与一条碱性多肽链(B链)通过二硫键连接形成。其中,酸性多肽包括Ala、A1b、A2、A3、A4和A5,分子量约为34.8 ku;碱性多肽包括B1a、B1b、B2、B3和B4,分子量约为19.6 ku[19]。

大豆β-伴球蛋白(7S)是由α、α′和β三种亚基组成的三聚体球蛋白。目前研究发现约有10种存在形式,其中有6种已经被鉴定出来,分别是ααα,ααβ,αββ,ααα′,αα′β,α′ββ[20]。其中7S球蛋白中的Gly m Bd 28 K和Gly m Bd 30 K和Gly m Bd 60 K(β-伴球蛋白的α-亚基)是大豆中的主要致敏原[18]。β-伴大豆球蛋白的α-亚基能被25%大豆过敏患者的血清识别[21]。Krishnan 等[18]研究表明,β-伴大豆球蛋白的α-亚基、α′-亚基和β-亚基均为潜在的过敏原。Guo等[22]研究大鼠时发现,α′-亚基具有免疫刺激能力并可诱发过敏反应。

2 生物酶解法降低大豆蛋白抗原性的研究

2.1 酶解对大豆7S蛋白抗原性的影响

2.1.1 酶解降低大豆7S蛋白抗原性 Keum[23]等用胃蛋白酶水解大豆7S球蛋白,并用SDS-PAGE和酶联免疫分析法(ELISA)分析大豆蛋白分子和抗原性变化,发现7S球蛋白的亚基很快消失,其抗原性降低了50%以上。刘晓毅[24]等研究体内蛋白酶的体外消化实验,证明胃蛋白酶能有效降解7S组分,但是却无法完全水解掉30 ku和28 ku成分。王俊[25]等用胃蛋白酶、胰蛋白酶水解β-伴大豆球蛋白,产生了分子量分别约为52、30、25 ku的抗酶解肽段;用大豆β-伴球蛋白致敏的兔子血清做免疫印迹实验表明,这些肽段仍具有免疫活性,尤其是30 ku等肽段表现明显[26]。王锦欣[27]等通过胃蛋白酶和黑曲霉生产的酸性蛋白酶联合处理β-伴大豆球蛋白,可以将α′-和α-两种亚基完全消除,但是β-亚基依然表现出较强的完整性和免疫活性。Zhao[28]等研究认为,β-伴大豆球蛋白的β-亚基不易被胃蛋白酶水解,即使延长酶解时间或增加酶的用量也没有明显的酶解效果。黄婷[29]等用风味蛋白酶处理大豆分离蛋白,并采用间接竞争ELISA法测定酶解产物中β-伴大豆球蛋白的抗原性,表明在水解30 min后,7S组分的α-、α′-和β-亚基有明显的降解作用,生产了较小分子量的肽段,β-伴大豆球蛋白的抗原抑制率平均值达到21.79%。

Wang[30]等用碱性蛋白酶对豆粕处理10 min时,β-伴球蛋白的α-、α′-及β-亚基几乎完全清除,用ELISA试剂测定酶解物的抗原性仅剩余约4%;相比之下,用胰蛋白酶水解10 min时,抗原性剩余约45%,即使酶解120 min时抗原性还剩余30%以上。用乳酸杆菌产生的蛋白酶对大豆分离蛋白水解,几乎可以完全降解β-伴大豆球蛋白的3个亚基和大豆球蛋白的酸性、碱性肽链[31]。但该研究仅用电泳和反相色谱方法分析了酶解过程中大豆蛋白的分子组成,并未采用相应的抗体反应测定抗原性变化。

就目前的研究结果看,用动物来源的蛋白酶水解时,大豆β-伴球蛋白的β-亚基比其他亚基较难水解彻底,这也是大豆过敏者食用大豆蛋白或者大多数幼小动物饲用大豆原料后,虽然经过消化道酶解仍然发生过敏现象的原因;而用微生物或植物来源的蛋白酶水解大豆蛋白时,β-亚基的变化和抗原性降低程度较明显。

白小娟[32]等用风味蛋白酶水解大豆分分离蛋白并用ELISA试剂法分析抗原性,发现当蛋白浓度为5%、pH7.5、加酶量1000 U/g、在50 ℃酶解120 min、条件下,大豆蛋白抗原蛋白P34(7S的一种)的致敏性完全消除。郑环宇[33]等将超高压和风味蛋白酶联合处理P34时,将消除P34致敏性的酶解时间由120 min缩短到了60 min。Meinlschmidt[34]等发现,大豆β-伴球蛋白经400 MPa高压处理后再用风味蛋白酶水解,抗原消除率可达99.5%。可见,两种方法的结合对降低大豆蛋白抗原性有一定的协同效果。

赵巧丽[35]等以豆乳为原料用木瓜蛋白酶水解,在加酶量为3500 U/mL 酶解15 min 时,β-伴球蛋白的α′-亚基被完全水解,抗原活性残留率为56.6%。Meinlschmidt[36]等研究了五种蛋白酶(碱性酶、风味酶、中性酶、木瓜蛋白酶和Corolase)及其不同组合,且采用一步和两步水解方式对大豆抗原蛋白的水解效果,发现木瓜蛋白酶和风味蛋白酶的组合水解效果最好,产生的多肽片段分子量均小于20 ku,可以将大豆β-伴球蛋白和大豆球蛋白等主要过敏原有效水解。这表明不同酶有不同的作用位点,可将蛋白分子水解到较小肽段,破坏抗原决定簇,从而有效降低其抗原性。

2.1.2 酶解不能降低大豆7S蛋白的抗原性 与前述酶解降低大豆7S球蛋白抗原性的结果相反,有些研究发现,某些酶解条件下,大豆蛋白的抗原性不仅没有降低,反而出现增加的现象。

Rakhi[37]等采用SDS-PAGE、IgE印迹法和细胞培养分析发现,大豆分离蛋白经过酶解后其抗原性并没有减少,而且胰凝乳蛋白酶和菠萝蛋白酶水解大豆分离蛋白后,抗原性反而有所增加,其中β-伴球蛋白水解的片段是引起抗原性升高的主要原因。Keum[23]等用胃蛋白酶水解7S球蛋白后,其抗原性可以降低50%以上。然而,先用胃蛋白酶、再用胰凝乳蛋白酶水解得到的酶解物抗原性又有所恢复,在10名大豆过敏者中,有5人的血清可与酶解产物发生免疫反应。其中,酶解产物中有2个片段(分子量分别为20～25和13～16 kDa)表现出与10位大豆过敏者血清有反应活性。

上述结果之所以不太一致,可能与选择的抗原性测定方法有一定关联。大部分研究者采用ELISA法检测,少数采用免疫印迹法;另外,即使均采用大豆过敏者血清,但对同一测试样品并不是所有过敏者血清都会发生免疫反应[38]。所以体外实验结果与临床症状可能存在不一致之处。

2.1.3 酶解去糖基化降低大豆7S蛋白抗原性 针对上述酶解后7S大豆蛋白亚基消失,但抗原性并未完全消失,甚至酶解产生的低分子量肽链仍然表现出一定的抗原性的现象,还可能与大豆蛋白肽链中糖的存在有一定关联性。Hiemori[39]等用赖氨酰肽链内切酶除去7S大豆蛋白Gly m Bd 28K组分的糖链后其抗原性消失。Miryam[40]等用糖苷酶水解脱去大豆抗原蛋白的糖链后,用Western印迹法和直接ELISA测定发现其免疫反应大大降低,而且进一步研究发现,大豆β-伴球蛋白难以被胃蛋白酶完全水解,脱糖基处理后则易被胃液消化,但糖基化的α和β亚基仍有部分保留下来[41]。这可能是蛋白酶水解无法完全消除其免疫活性的重要原因。

2.2 生物酶解降低大豆11S蛋白抗原性

大豆11S球蛋白也是主要抗原蛋白之一,相对于7S蛋白而言,受关注程度较低。王之盛[42]等研究认为,复合酶制剂在酸性条件下,较容易酶解大豆中11S抗原蛋白;而在中性、碱性条件下易于酶解7S和2S抗原蛋白;表明复合酶制剂在不同的酸碱环境下,酶解特性存在一定的差异。Lee[43]等用胰凝乳蛋白酶和胃蛋白酶研究发现,大豆11S球蛋白中的酸性多肽链比碱性多肽链更容易水解;通过凝胶过滤法将11S酶解物各组分分开,并用大豆过敏者血清鉴定发现,肽分子量小于20 ku的成分几乎没有免疫活性。但是相对于上述酶水解效果,胰蛋白酶有效水解11S蛋白则相对较难。如:Wang[30]等发现胰蛋白酶对11S的酸性亚基以及碱性亚基几乎没有作用;Zhao[28]等也发现胰蛋白酶不易将大豆11S球蛋白的B多肽链水解。

相比以上动物蛋白酶,植物蛋白酶和微生物蛋白酶更容易水解大豆11S球蛋白。Shutov[44]等研究发现,木瓜蛋白酶很容易水解大豆11S球蛋白,有效降低大豆11S球蛋白的抗原活性,且11S球蛋白酸性肽链的酶解产物还可以促进碱性肽链的水解。Wang[30]等用Alcalase碱性蛋白酶对豆粕处理10 min,能够明显降解大豆11 S球蛋白的酸性亚基和碱性亚基。杨春华[45]等用碱性蛋白酶与转谷酰胺酶联合水解大豆11S球蛋白,发现除发生酶解反应外,还可以发生交联反应,从而达到降低大豆蛋白抗原性的效果。

2.3 微生物发酵降低大豆蛋白抗原性

通过微生物发酵降低或者清除大豆蛋白的抗原活性也是目前研究和应用热点之一。Lee[46]等通过乳酸乳球菌、球菌、曲霉和枯草芽孢杆菌以及其不同组合对蒸煮过的大豆进行发酵,提取大豆蛋白后用SDS-PAGE和免疫印迹法进行分析,发现大豆蛋白被降解为氨基酸或者分子量小于10 ku的肽,并且未检测到免疫活性。Frias[47]等对大豆进行固态发酵发现,米曲霉和米根霉发酵可降低66%和71%大豆蛋白抗原性,枯草芽孢杆菌发酵则可降低81%～86%。Amnuaycheewa[48]等发现用双歧杆菌、植物乳杆菌和酿酒酵母发酵豆粕可降低大豆抗原蛋白68%～72.7%。王波[49]等用植物乳酸杆菌对豆粉进行液态发酵48 h后,β-伴大豆球蛋白免疫活性降低71%,大豆球蛋白的免疫活性降低64%。

而Song[50]等研究发现,酿酒酵母液态发酵豆粕可明显降低大豆免疫活性,用乳杆菌、双歧杆菌发酵效果并不明显。之所以出现上述不一致的结果,可能与菌种的活性、接种量、发酵时间等条件有很大关系。尤其是固态发酵需要更长的发酵时间才有可能使微生物分泌的蛋白酶与大豆蛋白充分反应。

3 结论与展望

大豆是优质蛋白质的重要来源之一,但是大豆的致敏性一直是全世界普遍关注的食品安全问题。生物酶解法被认为是降低甚至完全消除大豆蛋白抗原性的有效方法[35]。尽管酶解大豆蛋白的文献很多,但往往关注大豆蛋白酶解后的溶解、乳化、发泡等食品加工性能的变化,而对生物酶解法降低大豆蛋白抗原性的研究近年来才有较多报道。当然,生物酶解法的酶解效果受酶的种类、酶解条件等多种因素的影响,酶解产物的抗原性测定方法也是目前研究结论不太一致的主要原因。因此如何有效降低或者完全去除大豆蛋白的抗原性,还需更加深入的研究。生物酶解法降低大豆蛋白抗原性过程中大豆蛋白加工性能的变化规律也是未来的重要研究方向。相信随着生物酶解法去除大豆蛋白抗原性研究的不断深入和新型酶的不断开发,既能降低大豆蛋白抗原性、又能获得较好加工性能的酶解方法将不断出现,并能有效应用于食品工业生产中。