皮肤黑色素瘤中神经母细胞瘤大鼠肉瘤基因突变分析

林 琳 倪 楠 赵海鹰 姜晓峰*

黑色素瘤作为皮肤肿瘤中侵袭性最高的恶性肿瘤之一，占皮肤恶性肿瘤的7%～20%[1]。研究表明，很多基因突变与黑色素瘤的发生、转移的相关性越来越密切[2-3]。黑色素瘤恶性度高、侵袭能力强，而且对化疗极不敏感，近年来，相关基因抑制剂在治疗晚期黑色素瘤上，取得了显著的疗效[4]。由于黑色素瘤发生相关基因较多，发现更多有效的治疗靶点成为研究的方向之一。

神经母细胞瘤大鼠肉瘤(neuroblastoma rat sarcoma，NRAS)基因全长85 kb，位于1号染色体，编码含495个氨基酸的蛋白质[5]。研究显示，在黑素瘤中，NRAS基因突变作为Ras家族中最常见的突变类型，突变率为20%[6-7]。NRAS是黑素瘤中第2个最常见的突变基因[8]。NRAS基因突变主要以Q6、G12、G13为主[9]。Uhara等[10]，通过对127例黑素瘤患者检测，发现NRAS基因突变率7.1%且主要突变发生在Q61位点上，总比例为77.8%，对NRAS基因进行突变研究，对个体化的靶向治疗有着重要的意义。本研究通过癌症基因组图谱集(the cancer genome atlas，TCGA)[11]公共数据，研究NRAS基因突变在黑色素瘤中的发生情况，为靶向治疗提供有价值的线索。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取1978-2013年TCGA数据集中收集的黑色素瘤病471例，数据的使用符合TCGA的出版要求。按NRAS基因突变情况，将471例病例资料分为两组，未突变组373例，年龄15～90岁，中位年龄59岁；突变组98例，年龄30～86岁，中位年龄56岁；性别、肿瘤位置、肿瘤分期、发病人种等临床资料见表1。

1.2 统计学方法

应用cBioPortal和SPSS 17.0统计分析软件，分析TCGA 数据集中NRAS基因突变情况，基因共表达、基因网络调控及生存分析。生存分析采用Kaplan-Meier和log-rank检验法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 471例黑色素瘤患者临床特征[例(%)]

2 结果

2.1 NRAS基因突变

在471个病例中，NRAS基因突变98例，占比20.80%(98/471)；在98例NRAS基因突变病例中，突变位点以Q61R为主，共41例，占41.84%(41/98)，Q61K突变31例，占31.63%(41/98)，Q61L突变10例，占10.20%(10/98)，Q61H突变4例，G12A突变1例，G12D突变1例，G12R突变2例，G13D突变1例，G13R突变2例，其他突变5例(见表2)。

表2 98例NRAS基因突变 [例(%)]

2.2 基因共表达分析

应用cBioPortal分析黑色素瘤TCGA数据集，进行基因共表达研究，结果显示BCAS2、CSDE1、GNAT3、SIKE1基因mRNA与NRAS基因表达呈现一定程度的正相关(如图1所示)。

图1 NRAS 基因共表达分析示图

2.3 生存期分析

应用cBioPortal分析黑色素瘤TCGA数据集，采用Kaplan-Meier Plotter在线数据进行生存分析，结果显示，NRAS基因突变组与未突变组生存期无统计学差异，如图2所示。

图2 黑色素瘤患者生存期分析曲线图

2.4 调控网络分析

cBioPortal整合来自人类蛋白参考数据库(human reference protein database，HPRD)、反应组学(Reactome)、国立癌症研究所自然版(National Cancer Institute，NCI)-Nature和斯隆-凯特琳癌症中心(The Memorial Sloan-Kettering Cancer Center(MSKCC) Cancer Cell Map)的数据，并对此进行分析，此调控网络中包含51节点，包含NRAS基因和其50个相关基因，分析结果如图3所示。

图3 调控网络分析示图

3 讨论

Ras基因家族包括NRAS基因、KRAS基因和HRAS基因，能调节细胞生长、增殖和分化。多项研究表明，NRAS基因突变与结直肠癌、黑色素瘤、急性髓细胞白血病等肿瘤的进程有着密切的联系[11-13]。本研究结果显示，在471个皮肤黑色素瘤病例中，NRAS基因突变表明，NRAS(R132)突变与黑色素瘤的发生、进展有较高程度的相关性。本研究还发现BCAS2、CSDE1、GNAT3、SIKE1等基因mRNA与NRAS基因表达呈现一定程度的正相关，其中CSDE1基因已有研究报道与黑色素瘤的侵袭、转移相关[14]。BCAS2、GNAT3、SIKE1基因与黑色素瘤的相关性还需要进一步的研究。调控网络分析结果显示，调控网络中共含51节点，包含NRAS基因和其50个相关基因，这些基因表明黑色素瘤的发生、发展与MAPK/ERK信号通路相关，此结果与Tonks等[15]研究报道一致。

目前，黑色素瘤的治疗方法以手术切除为主，同时根据其他因素结合放疗、化疗、免疫治疗等措施，而这些治疗都具有相应的局限性，探索更多的治疗方法尤为重要。有研究表明，针对一些基因突变的病例，如BRAFV600E、KIT基因突变，一些基因靶向的药物已经进入临床Ⅰ期、临床Ⅱ2期实验，并证实其有效性[16-17]。

这些研究为进一步探讨NRAS基因突变与黑色素瘤的发生奠定了一定的基础，并提示NRAS的Q61基因突变有可能成为黑色素瘤新的靶向治疗位点，为靶向治疗研究提供新的思路。

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