Ghrelin及其受体和酰基化酶在羔羊不同组织的表达差异研究

赵红琼，王 琴，徐新明，付 强，史慧君，侯 宇，杨 阳

(1.新疆农业大学动物医学学院，新疆乌鲁木齐 830052；2.新疆畜牧科学院畜牧研究所，新疆乌鲁木齐 830000)

Ghrelin最初是由Kojima M等[1]于1999年从大鼠胃中发现并分离出的一种28个氨基酸的多肽，是生长激素促分泌素受体(growth hormone gecretagogue-receptor，GHS-R)的内源性配体，其氨基末端第3位的丝氨酸酰基化是其结合受体和发挥生物学作用必需的。Ghrelin主要在胃肠黏膜的X/A内分泌细胞中合成，具有调控生长激素分泌，促进摄食、胃肠运动，调节能量平衡和心血管系统等多种生物学作用[2-3]。GHS-R是一个拥有7次跨膜结构域的G蛋白偶联受体，包含GHS-R1a和GHS-R1b两种亚型，其中GHS-R1a是Ghrelin的功能性受体。GHS-R1a广泛地分布在人和大鼠的下丘脑、垂体、腹内侧核、脑干、漏斗核和海马区等中枢神经系统，以及胃、肠、心、肝、脾、胰腺、甲状腺、肾上腺、睾丸、卵巢和乳腺等外周组织中[4-7]，该功能性受体在垂体和下丘脑中浓度最高[8-10]。Ghrelin受体的广泛分布，表明Ghrelin同有机体的多种生物学作用相关。2008年，Gutierrez J A等[11]和Yang J等[12]发现了使Ghrelin酰化的酶，命名为Ghrelin O-酰基转移酶(Ghrelin O-acyltransferase，GOAT)。GOAT在能量平衡的调控中起着重要作用[13]。已经在小鼠的胃、肠、睾丸、垂体和下丘脑中检测到GOAT mRNA[10]，并且发现其主要在人的胰腺和胃中表达[11]。然而，对于Ghrelin系统(包括Ghrelin、GHS-R和GOAT)的分布研究主要针对人和鼠，对反刍动物的研究甚少。本试验采用real-time PCR检测Ghrelin系统在羔羊各组织中的表达量，以期为探究Ghrelin系统在调节反刍动物生物学功能等方面提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物来源及样品处理 选取8只4月龄新疆细毛羊，公羔，体重18.2 kg±0.8 kg，来源于新疆科创畜牧繁育中心。羔羊颈动脉放血后处死，迅速取下丘脑、垂体、瘤胃、皱胃底、皱胃窦、十二指肠、空肠、回肠、心、肝、脾、肾、胰腺、睾丸等样本，放于灭菌的冻存管中并立即放到液氮罐中迅速冷冻，后将各样品组织储存在-80℃，用于提取总RNA。

1.1.2 主要试剂 Trizol试剂盒，美国Invitrogen公司产品；HiFiScript cDNA 第一链合成试剂盒、2×EsTaqPCR Master Mix(含染料)、高纯度质粒小提试剂盒，北京康为世纪生物科技有限公司产品；DNA Marker DL 2 000、普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司产品；pEASY○R-T1 Cloning Vector、Trans1-T1 PHage Resistant化学感受态细胞，北京全式金生物技术有限公司产品；QuantiFast○RSYBR Green PCR 试剂盒，德国QIAGEN公司产品。

1.1.3 主要仪器 5415R型低温高速离心机，德国Eppendorf公司产品；One Drop紫外分光光度计，南京五义科技有限公司产品；普通 PCR扩增仪、Gel Doc TM XR+凝胶成像系统，美国Bio-Rad公司产品；核酸电泳仪，北京市六一仪器厂产品；ABI7500快速型实时荧光定量PCR系统，美国应用生物系统公司产品。

1.2 方法

1.2.1 引物的设计与合成 根据GenBank中公布的绵羊Ghrelin、GOAT、GHS-R mRNA序列，用Primer Premier 5.0软件设计特异性引物，扩增目的片段。引物的序列见表1，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

表1 Ghrelin、GOAT和GHS-R基因的引物参数

1.2.2 总RNA的提取及反转录 利用Trizol试剂盒一步法提取下丘脑、垂体、瘤胃、皱胃底、皱胃窦、十二指肠、空肠、回肠、心、肝、脾、肾、胰腺、睾丸的总RNA，用DEPC水稀释，通过微量测定仪测定总RNA的纯度和浓度，即OD260/OD280=1.8～2.0符合要求，将RNA样品分装后保存在-80℃，备用。

利用HiFiScript cDNA第一链合成试剂盒，按照说明书步骤进行反转录。用随机引物对总RNA进行反转录，反应体系为20 μL，其组成为1 μg总RNA，4 μL随机引物dNTP Mix(2.5 mmol/L)，Primer Mix 2 μL，RNA无酶水补足到13 μL，70℃水浴10 min，迅速冰浴2 min，继续加入4 μL 5 × RT buffer，2 μL DTT(0.1 mol/L)，1 μL HiFiScript 反转录酶(200 U/μL)，混合均匀，50℃水浴15 min，85℃水浴5 min。瞬时离心，置于冰上冷却后，将反转录产物保存于-20℃，备用。

1.2.3 real-time PCR反应 采用绝对实时荧光定量PCR，利用核酸蛋白检测仪对目的基因的质粒进行浓度测定。根据公式:质粒拷贝数(拷贝/μL) = 6.02×1023(拷贝/mol)×质粒浓度(g/μL)/质粒分子质量(g/mol)，得出质粒拷贝数，然后将质粒进行10倍梯度稀释，分别稀释成1×101～1 ×108拷贝/μL的8个梯度，作为标准品。根据拷贝数和标准品的Ct值，得出线性方程。线性方程的可信度在斜率k为-3～-3.5，扩增效率E为0.9～1.2，R2大于0.98。实时荧光定量PCR分析采用ABI7500快速型实时荧光定量PCR系统进行，使用快速定量SYBR Green PCR试剂盒。反应体系为20 μL，其组成为目的基因引物1 μmol/L，模板cDNA 2 μL，2×SYBR Green Master Mix 10 μL，DEPC水补足到20 μL。反应条件为：95℃ 5 min;95℃ 10 s，60℃ 30 s，40个循环;待测样品设3个重复。

2 结果

2.1 Ghrelin mRNA在羔羊各组织中的表达

图1显示,Ghrelin在羔羊皱胃底中的基因表达量的对数拷贝数为9.78 拷贝/μg±0.56 拷贝/μg，极显著高于在瘤胃中的表达量(5.94拷贝/μg±0.43拷贝/μg)(P<0.01)，并且显著高于在皱胃窦中的表达量(P<0.05)。由图2可知，Ghrelin在十二指肠中表达量为9.78拷贝/μg±0.56拷贝/μg，均显著高于在空肠和回肠中的表达量(P<0.05)。图3显示,在下丘脑、垂体、心、肝、脾、肾、胰腺和睾丸8种组织中，Ghrelin在羔羊的胰腺中表达量最高(6.68拷贝/μg±0.38拷贝/μg)，显著高于在垂体、心、脾、肾中的表达量(P<0.05)，而其他组织之间差异均不显著(P>0.05)。通过对上述组织统计分析可知，Ghrelin在羔羊各组织中均有表达，其中在皱胃底中的基因表达量最高。

图1 Ghrelin mRNA在羔羊胃中的表达

图2 Ghrelin mRNA在羔羊小肠中的表达

图3 Ghrelin mRNA在羔羊神经和外周组织中的表达

2.2 GHS-R在羔羊不同组织中的表达

图4显示，在下丘脑、垂体、瘤胃、皱胃底、皱胃窦、十二指肠、空肠、回肠、心、肝、脾、肾、胰腺和睾丸等14种组织中，GHS-R在羔羊垂体中的表达量(5.50拷贝/μg±0.11拷贝/μg)最高，显著高于瘤胃、心、脾、睾丸组织(P<0.05)；GHS-R在下丘脑中的表达量次之(5.17拷贝/μg±0.07拷贝/μg)；其次，肝组织(5.15拷贝/μg±0.05拷贝/μg)极显著高于心(P<0.01)，并显著高于睾丸(P<0.05)；另外，在胰腺(5.04拷贝/μg±0.13拷贝/μg)和肾(5.05拷贝/μg±0.08拷贝/μg)的表达也显著高于心。然而GHS-R在羔羊胃肠消化道中的表达均差异不显著(P>0.05)。

2.3 GOAT在羔羊不同组织中的表达

图5显示，GOAT在羔羊瘤胃、皱胃底、皱胃窦的表达不同，在皱胃底中的基因表达量最高(7.30拷贝/μg±0.54拷贝/μg)，均显著高于在瘤胃和皱胃窦中的表达量(P<0.05)，而在瘤胃和皱胃窦的表达差异不显著(P>0.05)。GOAT在羔羊十二指肠、空肠和回肠的表达无显著差异(P>0.05)。图6显示，在下丘脑、垂体、心、肝、脾、肾、胰腺和睾丸等8种组织中，GOAT在羔羊睾丸中的基因表达量最高(6.34拷贝/μg±0.28拷贝/μg)，显著高于在肾组织的表达量(5.64拷贝/μg±0.09拷贝/μg)(P<0.05)，而在其他脏器组织之间差异不显著(P>0.05)。通过整体统计分析可知，GOAT高表达于羔羊的皱胃底，其次是睾丸、胰腺。

3 讨论

本试验结果显示，Ghrelin、GHS-R和GOAT mRNA在断奶羔羊的下丘脑、脑垂体、瘤胃、皱胃底、皱胃窦、十二指肠、空肠、回肠、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、胰腺、睾丸组织中均有表达。其中，Ghrelin mRNA在皱胃底中的表达最高，其次是在十二指肠和胰脏。黄治国等[14]报道，不同日龄的哈萨克羊和新疆细毛羊的下丘脑、垂体、心脏、肝脏、瘤胃、网胃、瓣胃、皱胃、十二指肠和背最长肌均有Ghrelin mRNA的分布和表达，其中，在皱胃中的表达量显著高于其他组织。杨连玉等[15]报道，新生仔猪和90日龄生长猪的下丘脑、垂体、胃底部、十二指肠、空肠、回肠、胰腺、肝脏、肾脏、心肌等组织部位中均有Ghrelin mRNA分布。Tena-Sempere M等[16]和Barreirom L等[17]研究报道，Ghrelin mRNA在大鼠睾丸组织中表达，这些结果同本试验结果基本一致。近年来，国内外越来越多的研究发现，Ghrelin mRNA还分布在淋巴细胞、卵巢、胎盘和甲状腺等[18]，并且广泛地存在于鱼类、鸟类、两栖动物以及多数哺乳动物体内[19-20]。动物的胃肠道是Ghrelin的主要来源，并且含有大量的Ghrelin，胃内Ghrelin主要由胃底部黏膜的X/A样细胞分泌。电镜观察发现这些细胞与毛细血管网紧密相连，这可能为Ghrelin进入血液循环，在内分泌系统发挥作用提供保障。大量的研究显示，Ghrelin对反刍动物有广泛的生物学作用，如促进GH的释放，促进食欲、调节能量平衡，促进胃肠蠕动，参与机体免疫作用等。

图4 GHS-R mRNA在羔羊不同组织的表达

图5 GOAT mRNA在羔羊胃中的表达

图6 GOAT mRNA在羔羊神经和外周组织的表达

我们发现GHS-R mRNA在采集的羔羊组织中均有分布，主要分布在垂体和下丘脑，其中在垂体中的表达量极显著高于外周组织(心、胰腺、脾、肾和睾丸)。Miller D等[21]报道，在成年绵羊体内，Ghrelin和GHS-R1a表达见于胃(皱胃)、垂体前叶、睾丸、卵巢、下丘脑和后脑。于高水等[22]报道，GHS-R1a在奶山羊胃肠道广泛分布，在皱胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠和直肠GHS-R1a mRNA表达量显著高于瘤胃、网胃和瓣胃的表达。高风英等[23]报道，莫桑比克罗非鱼在垂体中GHS-R1a mRNA的表达量最高，脑部较低；在外周组织中也有广泛分布，其中肝、肌肉和心的表达量较高。通过RT-PCR，发现在胃、小肠、结肠、肝、肾、睾丸、胰腺、心和T细胞中均有GHS-R表达[24]。我们的研究表明，GHS-R主要在垂体中表达，在胃肠和心、肝、脾、肾、胰腺和睾丸等外周组织中以低水平表达，相比之下，其内源性配体Ghrelin显示在胃肠和外围组织广泛表达。Ghrelin的生理功能除了促进食欲，调节能量代谢以外，最重要的一个功能可通过其受体GHS-R促进GH的分泌。Ghrelin在胃肠的广泛分布提示 Ghrelin通过GHS-R对羔羊胃肠功能可能具有调节作用。

本试验结果显示GOAT mRNA在羔羊的所有组织中均有表达，在皱胃底的表达量显著高于其他组织，其次是睾丸、胰腺。Gonzalez C R等[25]报道，在大鼠的下丘脑、胃、小肠、卵巢、血清、胎盘、肌肉、心脏和肾上腺中均有GOAT mRNA的表达。在小鼠中，GOAT mRNA在胃和小肠表达量最高，其次是睾丸。Gutierrez J A等[11]报道，在人体内检测到GOAT转录水平最丰富的是胃和胰腺。GOAT是负责Ghrelin酰化的特异性酶，它的产生与Ghrelin的产生应该是保持一致的，本研究中GOAT mRNA在羔羊胃中的大量表达对应于Ghrelin mRNA的表达模式。由于GOAT的结构域在物种中是高度保守的，并且其独特的底物是Ghrelin，这种酶成为调节Ghrelin作用的优良靶标。Ghrelin系统在羔羊不同组织的的广泛分布和表达特点为Ghrelin参与对反刍动物生理功能的调节提供了生理学依据，为更深入认识Ghrelin的生物学作用积累了科学资料。

本研究表明,Ghrelin、GHS-R和GOAT mRNA在羔羊各组织中均有表达，Ghrelin和GOAT mRNA在皱胃底表达量最高，而GHS-R mRNA在下丘脑和垂体表达量高，提示反刍动物Ghrelin主要在皱胃底合成，通过下丘脑和垂体调控动物生长发育。

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